基于HRP催化過硫酸鹽陰極電致化學(xué)發(fā)光的非標(biāo)記型免疫傳感器

汪廣杰，王東，張濤*

（1.中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤診治中心，四川成都 610083）

（2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042）

基于HRP催化過硫酸鹽陰極電致化學(xué)發(fā)光的非標(biāo)記型免疫傳感器

汪廣杰1，王東2，張濤1*

（1.中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤診治中心，四川成都 610083）

（2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042）

基于酶催化陰極電致化學(xué)發(fā)光（ECL）構(gòu)建靈敏的免疫傳感器用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。利用過氧化氫酶（HRP）催化H2O2底物反應(yīng)產(chǎn)生大量溶解氧，催化增強(qiáng)S2O82-的陰極ECL信號(hào)，構(gòu)建非標(biāo)記型免疫傳感器。當(dāng)抗原蛋白在電極表面與抗體形成免疫復(fù)合物時(shí)，屏蔽了檢測(cè)液中底物與電極表面固載酶之間的接觸并阻礙了電子傳遞，使ECL信號(hào)強(qiáng)度隨抗原濃度增加而減小，建立ECL信號(hào)與待測(cè)物濃度之間的線性依賴關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)血清中腫瘤標(biāo)志物CEA的快速靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)1.04 ng/mL。

過硫酸鹽；HRP；陰極電致化學(xué)發(fā)光；免疫傳感器

0 引言

酶催化由酶與底物實(shí)時(shí)反應(yīng)從酶的氧化還原中心傳送電子到工作電極表面并往復(fù)傳遞電子，從而循環(huán)放大電信號(hào)，是電化學(xué)免疫檢測(cè)中常用于信號(hào)放大的方法之一[1～5]。但這一信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)發(fā)光（ECL）領(lǐng)域的應(yīng)用極為有限，Zhang等在乙醇脫氫酶催化下通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸與乙醇反應(yīng)原位生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作為共反應(yīng)試劑，與聯(lián)吡啶釕反應(yīng)增強(qiáng)其ECL信號(hào)[6]。Cao等利用葡萄糖氧化酶與納米材料的協(xié)同催化促進(jìn)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光[7]。Jiang等基于卟啉鐵可作HRP模擬酶催化過氧化氫反應(yīng)并促進(jìn)魯米諾的ECL反應(yīng)構(gòu)建生物傳感器[8]。尋找可供酶催化的ECL活性物質(zhì)是將酶催化與ECL技術(shù)結(jié)合的關(guān)鍵。

過硫酸鹽（S2O82-）易被電化學(xué)氧化為自由基，當(dāng)水溶液與這一強(qiáng)氧化態(tài)的中間體反應(yīng)后生成單線態(tài)氧，產(chǎn)生陰極電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象[9～10]。富氧條件可增強(qiáng)該物質(zhì)的發(fā)光信號(hào)，許多酶與底物的反應(yīng)可產(chǎn)生大量溶解氧，因而對(duì)S2O82-的ECL信號(hào)有潛在的催化放大作用[11～12]。

該文擬就單一HRP酶對(duì)S2O82-的電化學(xué)發(fā)光催化作用進(jìn)行考察，并用于構(gòu)建非標(biāo)記型免疫傳感器?；诳乖陔姌O表面的免疫結(jié)合，屏蔽了檢測(cè)液中底物與電極表面固載酶之間的接觸并阻礙電子傳遞，使ECL信號(hào)強(qiáng)度隨抗原濃度增加而減小，建立ECL信號(hào)與待測(cè)物濃度之間的線性依賴關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)血清中腫瘤標(biāo)志物CEA的快速靈敏檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型電致化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁分析儀器公司），CHI660D型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），F(xiàn)A2004A電子天平（上海精天電子儀器有限公司），DS-1510DT超聲清洗儀（上海生析超聲儀器有限公司）。

牛血清白蛋白（BSA，美國(guó)Sigma公司）；辣根過氧化氫酶（HRP，美國(guó)Sigma公司）；過氧化氫（濃度30%，中國(guó)重慶化學(xué)制品公司）；氯金酸（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；CEA抗原和Anti-CEA抗體（中國(guó)鄭州博賽生物技術(shù)公司）；0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（pH=7.4，由0.1 mol KH2PO4、0.1 mol Na2HPO4和0.1 mol KCl配制）。所用其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

臨床血清樣品來自于重慶大坪醫(yī)院腫瘤中心。

1.2 目標(biāo)ECL免疫傳感器的制備

玻碳電極(GCE，φ＝4 mm)用0.3 μm、0.05 μm Al2O3糊打磨拋光，分別先后在蒸餾水、乙醇、蒸餾水中超聲洗滌3 min，室溫下晾干備用。預(yù)處理好的GCE浸入到3 mL 1%的氯金酸溶液中，在-0.2 V電位下電沉積30 s，以修飾納米金顆粒在電極表面。將該電極浸入200 ug/mL anti-CEA溶液孵育8 h(4℃)，用20 uL HRP溶液封閉電極表面非特異性結(jié)合位點(diǎn)30 min。免疫電極與20 μL CEA抗原在室溫25℃下孵育20 min，將抗原免疫結(jié)合到電極表面進(jìn)行檢測(cè)。免疫電極組裝及檢測(cè)原理詳見圖1。

圖1 免疫傳感器的組裝及檢測(cè)原理示意圖Fig.1Schematic for the immunosensor fabrication and detection

1.3 測(cè)試方法

實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)：以目標(biāo)免疫電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl為參比電極進(jìn)行檢測(cè)。采用循環(huán)伏安電化學(xué)發(fā)光(CV-ECL)，光電倍增管高壓800 V，電位掃描速度為100 mV/s，電位掃描范圍為-2.0～0.0 V(vs Ag/AgCl)。檢測(cè)底液為3 mL 0.1 mol/L K2S2O8底液中加入1×10-4mol/L的H2O2底物。實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

免疫電極與含0 ng/mL CEA抗原（樣品空白）孵育，測(cè)得-1.8 V電位條件下的ECL強(qiáng)度I0為空白信號(hào)。免疫電極按低濃往高濃的順序依次與不同濃度CEA抗原溶液孵育，測(cè)定-1.8 V電位下ECL強(qiáng)度Ii為檢測(cè)信號(hào)?？乖陔姌O表面的免疫結(jié)合，阻礙了電極表面HRP酶與溶液中H2O2底物的接觸，因而隨抗原濃度增加ECL信號(hào)降低。以扣除空白信號(hào)后的ECL強(qiáng)度變化值ΔIi=I0－Ii(i=1，2，3……)對(duì)抗原濃度作圖，線性方程擬合，得ECL測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度工作曲線，用于臨床血清樣品測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)免疫傳感器組裝過程的ECL表征

根據(jù)傳感器組裝過程中，各修飾層所造成的ECL信號(hào)變化，可以對(duì)傳感器的組裝過程進(jìn)行跟蹤檢測(cè)(圖2)。裸玻碳電極在-1.8 V中有明顯的ECL信號(hào)(曲線a)，說明S2O82-確實(shí)可以產(chǎn)生陰極ECL。在電極表面電沉積納米金顆粒后，納米金具有良好的導(dǎo)電性，使單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)數(shù)目增加，光量子產(chǎn)率增加，ECL信號(hào)顯著增強(qiáng)(曲線b)。在電極表面組裝上抗體后，由于蛋白分子阻礙電子傳遞，同時(shí)也阻礙了溶液中S2O82-向電極表面的擴(kuò)散，從而使得ECL信號(hào)下降(曲線c)；用HRP封閉電極表面非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，同樣由于HRP蛋白對(duì)電子傳遞的阻礙作用，ECL信號(hào)進(jìn)一步降低(曲線d)。實(shí)驗(yàn)ECL信號(hào)變化與理論相符，故可以按照如上方法組裝免疫傳感器。

圖2 免疫傳感器組裝過程的ECL表征：(a)裸GCE，(b)電沉積納米金修飾電極，(c)共價(jià)結(jié)合抗體，(d)HRP封閉非特異位點(diǎn)，檢測(cè)底液為0.1 mol/L K2S2O8溶液Fig.2ECL characterization for immunosensor assembly process:(a)bare GCE,(b)electrodepositing nano-Au,(c) covalent bonding antibody,(d)blocking nonspecific site with HRP in 0.1 mol/L K2S2O8

2.2 ECL催化機(jī)理

免疫電極在含不同濃度H2O2的S2O82-底液中循環(huán)伏安掃描，如圖3所示，在-0.56 V和-1.40 V出現(xiàn)了過硫酸根和單質(zhì)氧的氧化峰[11]。隨著檢測(cè)底液中H2O2濃度增加，S2O82-和氧的氧化峰電流強(qiáng)度明顯增大，說明底物與電極表面HRP酶的反應(yīng)，對(duì)電子轉(zhuǎn)移過程有明顯促進(jìn)作用。

圖3 不同濃度H2O2與電極表面HRP酶反應(yīng)的電化學(xué)表征c1：10-6mol/L,c2：10-5mol/L,c3：10-4mol/LFig.3Electrochemical characterization for the reaction between the HRP enzyme and H2O2substrate with the level ofc1：10-6mol/L,c2：10-5mol/L,c3：10-4mol/L,respectively

推測(cè)其ECL催化機(jī)理如下：S2O82-能與共反應(yīng)試劑反應(yīng)來產(chǎn)生ECL信號(hào)，在負(fù)電位掃描時(shí)，溶解氧被還原為同時(shí)S2O82-被還原為反應(yīng)生成HSO4-和單線態(tài)氧的激發(fā)態(tài)，由于單線態(tài)氧的激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定進(jìn)而轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的三線態(tài)的氧，多余的能量以光的形式釋放出來[12]。H2O2底物與HRP酶的反應(yīng)產(chǎn)生大量的單質(zhì)氧，促進(jìn)三線態(tài)氧生成，增加了光量子產(chǎn)率，因而共反應(yīng)催化S2O82-的ECL信號(hào)。

2.3 底物濃度優(yōu)化

由于ECL信號(hào)強(qiáng)度隨底物濃度變化較大，故對(duì)底物H2O2濃度進(jìn)行優(yōu)化。隨著過氧化氫濃度從c1(1×10-6mol/L)到c3(1×10-4mol/L)增加，ECL信號(hào)強(qiáng)度逐漸增大，而在濃度增加到c4(1×10-3mol/L)，c5(1×10-2mol/L)后ECL信號(hào)強(qiáng)度逐漸下降。在c3時(shí)，ECL強(qiáng)度達(dá)到最大(圖4)，因此選擇最佳的過氧化氫濃度為1×10-4mol/L。

2.4 傳感器ECL響應(yīng)及線性測(cè)定

圖4 過氧化氫底物濃度優(yōu)化Fig.4Optimization for the H2O2substrate concentration

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)梯度濃度3.125 ng/mL，6.25 ng/mL，12.5 ng/mL，25 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL，200 ng/mL的CEA抗原進(jìn)行檢測(cè)，目標(biāo)免疫傳感器ECL響應(yīng)隨抗原濃度增加而有序降低，說明抗原濃度越大，則免疫結(jié)合到電極表面的量越多，越阻礙HRP酶與底物的接觸，ECL信號(hào)減小的越多(圖5A)。以ECL強(qiáng)度變化值ΔI對(duì)CEA抗原濃度的對(duì)數(shù)值lgc作圖，如圖5B所示，ECL強(qiáng)度的減小值與CEA抗原濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系，線性擬合得到線性方程：ΔI=-2 276.8+ 5 435.5 lgc，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 0。目標(biāo)ECL免疫傳感器對(duì)CEA抗原檢測(cè)的線性范圍為3.125～200 ng/mL；最低檢測(cè)下限為1.04 ng/mL (S/N=3)。由于HRP催化過氧化氫底物的反應(yīng)，催化放大了ECL信號(hào)，使抗原免疫結(jié)合導(dǎo)致的ECL信號(hào)變化更為明顯，從而得到比其他檢測(cè)方法更大的線性范圍和更低的檢出限。

圖5 目標(biāo)免疫傳感器對(duì)CEA抗原測(cè)定的ECL響應(yīng)(A)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig.5ECL response(A)and standard curve(B)for CEA antigen assay by proposed immunosensor

2.5 免疫傳感器對(duì)CEA測(cè)定的選擇性和特異性

為了檢測(cè)在該實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)免疫傳感器的選擇性和特異性，采用了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在正常人的血清樣品中加入CEA，通過檢測(cè)樣品中CEA的回收率以檢測(cè)目標(biāo)免疫傳感器的選擇性和特異性，檢測(cè)結(jié)果如表1所示：

通過上表可以看出，血清中加入不同濃度CEA抗原，回收率在97.5%～106.2%的合理范圍，說明血清中的其它蛋白對(duì)CEA測(cè)定干擾很小，該目標(biāo)免疫傳感器選擇性特異性較好。對(duì)每一個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定三次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.07%、4.69%、1.30%、0.37%、0.23%，平行測(cè)定的批內(nèi)差異也較小，目標(biāo)免疫傳感器重現(xiàn)性較好。

表1 目標(biāo)免疫傳感器對(duì)血清中CEA抗原的加標(biāo)回收測(cè)定Tab.1The recovery of standard CEA antigen addition in the serum sample with proposed immunosensor

3 結(jié)論

該文采用HRP催化底物H2O2反應(yīng)原位產(chǎn)生的溶解氧作為ECL反應(yīng)的共反應(yīng)試劑，并增強(qiáng)S2O82-的ECL信號(hào)。通過直接法構(gòu)建免疫傳感器，基于電極表面免疫結(jié)合抗原隔離HRP與H2O2底物的接觸并阻礙電子傳遞，使ECL信號(hào)減小，由ECL信號(hào)的減小量反映抗原濃度變化，對(duì)模型蛋白CEA抗原進(jìn)行測(cè)定。該方案實(shí)現(xiàn)了酶聯(lián)免疫在陰極電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)條件下的應(yīng)用。對(duì)抗原響應(yīng)表現(xiàn)出了好的靈敏度、選擇性和特異性。該傳感器模型證實(shí)，酶聯(lián)免疫與ECL技術(shù)結(jié)合，對(duì)蛋白標(biāo)志物的靈敏檢測(cè)有較好應(yīng)用前景。

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Horseradish peroxidase catalyzing the cathodic electrochemiluminescence of peroxydisulfate to construct the label-free immunosensor

Wang Guang-jie1，Wang Dong2,Zhang Tao1*
（1.Cancer Diagnosis and Treatment Centre，Military District General Hospital of Chengdu Military Region,Chengdu 610083,China）
（2.Cancer Centre,Daping Hospital and Research Institute of Surgery,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China）

A free-labeled ECL enzyme-linked immunoassay was successfully designed for the assay of CEA.This method employed the reaction between enzyme and substrate to generate amounts of dissolved oxygen for catalyzing the cathodic ECL signal of peroxydisulfate and constructing the label-free immunosensor.Based on the immuconjugated antigen on the electrode surface shielding the contact between the substrate and the solid-state mobilized enzyme,the ECL signal decreased with the increasing of analyte level.Thus,the label-free ECL immunosensor employed the enzyme to catalyze the cathodic ECL signal and built on the dependent relationship between ECL signal and the CEA antigen level.The detected limit for CEA antigen reached 1.04 ng/mL.

peroxydisulfate；horseradish peroxidase；cathodic electrochemiluminescence；immunosensor

四川省科技廳基金資助項(xiàng)目（2012SZ0058）；重慶市科技攻關(guān)(CSCQ，2009Ac5031)項(xiàng)目資助

*通訊聯(lián)系人,E-mail:zhangtao269@126.com