響應(yīng)曲面法優(yōu)化桑椹黃酮的超聲提取工藝

袁 玲，李建華

(湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000)

桑椹 (mulberry)為?？?Moraceae)植物桑的成熟果穗,在我國資源豐富，能藥食兩用。桑椹營養(yǎng)豐富，富含多種人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[1]，被譽為“第三代水果”。桑椹中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，能夠抗脂質(zhì)過氧化，具有延緩衰老及潤膚美容的功效[2]。桑椹黃酮還具有降血糖[3-4]活性和降尿酸[5]活性的作用。

隨著桑椹黃酮生物活性研究的深入，提取工藝也需優(yōu)化。常見黃酮提取方法有溶劑法、微波輔助提取法及超臨界流體提取法等[6]。其中超聲輔助提取法具有提取時間短、無污染、提取效率高及能耗低等優(yōu)點。響應(yīng)曲面優(yōu)化法(Response Surface Method, RSM)集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法于一體，通過描繪效應(yīng)對考察因素的響應(yīng)面，選擇較佳的響應(yīng)區(qū)，從而最終回推出自變量取值范圍，即最優(yōu)化實驗條件[7]。超聲法提取桑椹總黃酮的定性研究已有報道[8]，但還未見響應(yīng)曲面優(yōu)化桑椹黃酮的工藝試驗。以桑椹總黃酮含量為考察目標(biāo)，采用超聲波法提取，通過響應(yīng)曲面分析法探討提取過程中液料比、超聲功率以及提取時間對總黃酮得率的影響，優(yōu)選最佳工藝，預(yù)測最高得率，為桑椹黃酮的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用桑椹采自湖北省孝感市朋興鄉(xiāng)，45 ℃烘干，粉碎過50目篩備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Cary 60紫外可見分光光度計，安捷倫科技有限公司；DL-480B智能超聲波清潔器，上海之信儀器有限公司；SHZ-III循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 黃酮(以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物)檢測波長的確定

首先，準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.20 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后吸取2 mL于10 mL具塞比色管中，加5% 亞硝酸鈉溶液0.3 mL，充分搖勻，放置6 min后加入10% 硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，再加30%乙醇使總體積為10 mL，搖勻后放置10 min，在波長400～700 nm處掃描，確定其最大吸收波長[9]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取7支10 mL具塞試管，分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.20 mg/mL)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，按前述檢定波長的方法處理各管后，以0管為空白，在最佳波長處測定吸光度，繪制蘆丁濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

1.5 試驗設(shè)計

在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert軟件的中心組合設(shè)計(Central Composite Design，CCD)模塊中的二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，設(shè)計一組3因素5水平共計20次的實驗(full CCD 設(shè)計)，其中析因部分實驗次數(shù)為14次，星點數(shù)為5，保證均一精密性的中心點重復(fù)次數(shù)手動調(diào)整為6，本試驗設(shè)計的因素及水平見表1。

表1 中心組合設(shè)計因素水平表

1.6 桑椹總黃酮的提取與含量測定

準(zhǔn)確稱取1.00 g干粉末，按照中心組合設(shè)計試驗中設(shè)置的不同提取條件，分別進(jìn)行超聲提取，3 500 r/min離心5 min，抽濾收集各提取條件下得到的提取液，備用。各提取液按1 : 3處理后在最佳波長處測定吸光值，計算樣品中黃酮的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮波長檢測

將處理好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入直徑為1cm的石英比色皿中，在Cary 60紫外可見分光光度計中從450 ～700 nm進(jìn)行掃描，用隨機(jī)附帶的軟件繪制的掃描結(jié)果如圖1所示。

圖1 蘆丁波峰檢測

從圖1可以看出，蘆丁在可見光區(qū)有一明顯的吸收峰，儀器隨機(jī)軟件顯示，波峰所在波長為504 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液和質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，可得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。吸光度值y與蘆丁質(zhì)量濃度x(μg·mL-1)在10.0～60.0 μg·mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：

y=0.010x+0.01，相關(guān)系數(shù)(R2)=0.997。

圖2 蘆丁質(zhì)量濃度(μg·mL-1)與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 試驗結(jié)果

超聲功率、液料比以及提取時間三因素影響桑椹黃酮提取的試驗結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)曲面分析試驗設(shè)計方案及結(jié)果

2.4 模型的建立與方差分析

利用Design-Expert軟件對試驗結(jié)果(表2)進(jìn)行回歸及方差分析，發(fā)現(xiàn)本試驗結(jié)果符合三次方模型，經(jīng)過響應(yīng)曲面法的擬合計算得出該模型的決定系數(shù)R-Squared為0.961 6，表明該模型具有一定的可信度；校正系數(shù)RAdj=0.939 1，表明在黃酮含量總的變異中，有93.91%是由獨立變量引起的。失擬項不顯著，表明該模型能夠?qū)ιｉS酮的提取進(jìn)行預(yù)測和分析。

桑椹黃酮提取的方差分析結(jié)果見表3。通過方差分析可對模型的精確性做進(jìn)一步的判斷，該模型的F值為42.87，因誤差而接受該模型的概率不到0.000 1，表明模型的可信度很高，具有重要的參考價值；如果以0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)的話，在該模型中，A、B、C、B2、ABC和A2B表示顯著模型項，表明超聲功率、液料比和提取時間是影響桑椹黃酮提取的關(guān)鍵性因素。

優(yōu)化可得簡化的回歸方程為：R=0.115 79 + 0.015 620A+0.440 82B+0.097 522C-5.544 79×10-5AC-3.460 05×10-3B2- 5.280 99×10-6ABC-6.318 03×10-8A2B。這里R表示每克干桑椹提取黃酮的mg數(shù)。

2.5 參數(shù)優(yōu)化與驗證

在Design Expert 8.0軟件的優(yōu)化模塊中，將優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為最大值，求解得R的最優(yōu)值是18.85 mg·g-1，預(yù)測的最佳實驗條件為：超聲功率315W，液料比60 mL :1 g，提取時間12 min。為檢驗優(yōu)化條件的準(zhǔn)確性，按照上述優(yōu)化過的工藝參數(shù)，重復(fù)試驗4次，得其平均值為18.12 mg·g-1，與預(yù)測值相差3.87%，實驗值與預(yù)測值基本吻合。在優(yōu)化條件下做2次提取，結(jié)果表明桑椹黃酮的一次提取得率達(dá)81.6%～81.9%。

3 結(jié)論與討論

采用響應(yīng)曲面分析，研究了超聲提取桑椹中總黃酮的影響因素及最佳工藝條件，得到了各因素的最佳范圍，驗證實驗結(jié)果表明該條件下黃酮的平均提取率為18.12 mg/g。殷浩等[11]研究發(fā)現(xiàn)隨著桑椹的發(fā)育成熟，紅果2號和蜀椹1號中的總黃酮含量呈現(xiàn)雙峰變化，含量最高分別達(dá)到0.313%、0.444%。吳祖芳[1]采用分光光度法測得桑椹黃酮類物質(zhì)含量0.41%。本試驗中測得黃酮含量較高，可能與桑椹品種和采摘時間有關(guān)，也可能與優(yōu)化工藝有關(guān)，可做進(jìn)一步試驗。

與傳統(tǒng)法相比，優(yōu)化后的超聲提取顯著提高了桑椹黃酮的得率，縮短了提取時間，該提取工藝穩(wěn)定環(huán)保，有明顯的優(yōu)勢和較大的應(yīng)用前景。

表3 三次多項式模型方差分析表

[參 考 文 獻(xiàn)]

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