酸棗仁湯對(duì)REM睡眠剝奪老年大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及c-fos基因表達(dá)水平的影響

游秋云 王平 張舜波 黃攀攀 章程鵬

·基礎(chǔ)研究·

酸棗仁湯對(duì)REM睡眠剝奪老年大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及c-fos基因表達(dá)水平的影響

游秋云 王平 張舜波 黃攀攀 章程鵬

目的觀察酸棗仁湯對(duì)快動(dòng)眼 （REM）睡眠剝奪導(dǎo)致的老年大鼠腦皮層和海馬部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡及cfos基因表達(dá)Fos蛋白水平變化的影響。方法將自然衰老24月齡W istar大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組（等容生理鹽水），老年REM睡眠剝奪組（等容生理鹽水），陽(yáng)性對(duì)照組（舒樂(lè)安定0.18 mg／（kg·d）），酸棗仁湯低、高劑量組（12.96，25.92 g／（kg·d））。各組灌胃給藥2周后，除空白對(duì)照組外其余各組用自制改良多平臺(tái)法剝奪大鼠睡眠48 h制作老年大鼠REM睡眠剝奪模型。通過(guò)原位末端標(biāo)記法 （TUNEL）測(cè)定各組大鼠大腦皮層和海馬部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平，用免疫組化法檢測(cè)c-fos基因表達(dá)Fos蛋白的水平變化，探討酸棗仁湯對(duì)老年失眠引起的腦神經(jīng)損害及c-fos基因表達(dá)變化的影響。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，老年REM睡眠剝奪組大鼠腦皮層和海馬部位神經(jīng)凋亡細(xì)胞增多，F(xiàn)os蛋白表達(dá)明顯增高。與老年REM睡眠剝奪組比較，酸棗仁湯組腦神經(jīng)凋亡細(xì)胞及Fos蛋白表達(dá)明顯下降，但仍高于正常對(duì)照組。結(jié)論c-fos基因很可能參與了老年大鼠REM睡眠剝奪后的細(xì)胞凋亡過(guò)程，酸棗仁湯可能是通過(guò)抑制腦組織c-fos基因表達(dá)上調(diào)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

老年失眠；酸棗仁湯；大鼠模型；機(jī)制

酸棗仁湯出自 《金匱要略》，由酸棗仁、茯苓、知母、川芎、甘草等五味藥組成，諸藥相伍共奏養(yǎng)血安神、清熱除煩之功。臨床主治由肝血不足，陰虛內(nèi)熱引起的虛煩不眠證。研究表明，該方具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗應(yīng)激、改善睡眠時(shí)相結(jié)構(gòu)等作用［1-2］。課題前期研究通過(guò)促眠實(shí)驗(yàn)以及Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了酸棗仁湯的鎮(zhèn)靜催眠及改善學(xué)習(xí)記憶能力作用［3］，并與腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4］。為了進(jìn)一步探索酸棗仁湯改善睡眠質(zhì)量及腦保護(hù)作用靶點(diǎn)，本課題擬對(duì)老年REM睡眠剝奪引起的大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及關(guān)鍵基因進(jìn)行檢測(cè)，為酸棗仁湯治療老年失眠提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 自然老年健康24月齡W istar大鼠，雌雄各半，50只，體重（500±60）g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提前訂購(gòu)提供，許可證號(hào)SCXK（鄂）2008-0005。

1.2 藥物與試劑 酸棗仁湯由酸棗仁30 g、知母12 g、茯苓12 g、川芎12 g、甘草6 g組成。全部藥材購(gòu)自湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，常規(guī)方法 （以上方藥加5倍于藥材的溫水，浸泡30 min后微火煎煮15 min，文火煎20m in，濾出藥渣，分別將藥液濃縮成每毫升含生藥0.648 g、1.296 g的藥液。）煎煮后經(jīng)水提制成濃度為64.8%、129.6%，分裝滅菌后4℃保存?zhèn)溆?。分別按12.96、25.92 g／（kg·d）劑量（按體表面積系數(shù)換算，分別為人體臨床等效劑量的2倍和4倍）給藥。舒樂(lè)安定片 （山西亨瑞達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)111203）。

1.3 儀器與設(shè)備 睡眠剝奪箱 （自制），長(zhǎng)72 cm×寬48 cm×高30 cm的鼠箱，內(nèi)置6個(gè)直徑為8 cm、高8 cm的平臺(tái)，平臺(tái)間隔16 cm，平臺(tái)與鼠箱箱體壁間隔8 cm，在平臺(tái)周邊注滿水，水面距平臺(tái)面約1.0 cm，大鼠在平臺(tái)上可自行飲食飲水，并可在不同平臺(tái)上自由活動(dòng)，于箱體上放平行的不銹鋼絲籠罩，上面放水和食物；環(huán)境對(duì)照箱 （自制），與睡眠剝奪箱相似，但在距其底部8.0 cm處不放置平臺(tái)，而是放置一面細(xì)密鐵絲網(wǎng)，大鼠在網(wǎng)上可自由活動(dòng)，其他條件均與睡眠剝奪組相同，以形成與睡眠剝奪組相似的環(huán)境。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 將自然老年24月齡W istar大鼠50只（雌雄各半），隨機(jī)分成5組，每組10只：空白對(duì)照組；老年REM睡眠剝奪組；舒樂(lè)安定組 （陽(yáng)性對(duì)照組）；酸棗仁湯低、高劑量組。酸棗仁湯由酸棗仁30 g、知母12 g、茯苓12 g、川芎12 g、甘草6 g組成。舒樂(lè)安定組大鼠按0.18 mg／（kg·d）給藥，酸棗仁湯低、高劑量組分別按12.96、25.92 g／（kg·d）給藥，給藥容量均為2 m l／100 g。每日1次，連續(xù)2w。空白對(duì)照組、老年REM睡眠剝奪組均灌服等容積生理鹽水。

1.5 REM睡眠剝奪大鼠模型的制備 對(duì)模型組大鼠采用改良多平臺(tái)水環(huán)境法［5］，放置于自制的睡眠剝奪箱進(jìn)行REM睡眠剝奪48 h?？瞻讓?duì)照組則放置于環(huán)境對(duì)照箱中。

1.6 大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將大鼠處死后分別取腦皮質(zhì)及海馬區(qū)組織，4%多聚甲醛的固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片［6］。通過(guò)原位末端標(biāo)記法（TUNEL，TdT-mediated dUTP -biotin nick end labeling）測(cè)定大鼠大腦皮層和海馬部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平，具體方法按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行免疫熒光染色，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，高倍視野下（40×10）計(jì)數(shù)200個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 c-fos基因表達(dá)Fos蛋白水平檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)c-fos基因表達(dá)Fos蛋白的水平變化［7］。分別進(jìn)行Fos蛋白免疫組化染色，每張切片隨機(jī)取三個(gè)視野，光鏡下觀察細(xì)胞漿中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組對(duì)老年REM睡眠剝奪導(dǎo)致的大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 與空白對(duì)照組比較，老年REM睡眠剝奪組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增高（P＜0.01）；與老年REM睡眠剝奪組比較，酸棗仁湯低、高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 各組對(duì)老年REM睡眠剝奪大鼠大腦c-fos基因表達(dá)Fos蛋白表達(dá)水平的影響 與空白對(duì)照組比較，老年REM睡眠剝奪組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬部位c-fos基因表達(dá)Fos蛋白水平明顯增高（P＜0.01）；與老年REM睡眠剝奪組比較，酸棗仁湯低、高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬部位cfos基因表達(dá)Fos蛋白水平明顯降低（P＜0.05、P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表1 酸棗仁湯對(duì)老年REM睡眠剝奪大鼠大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的影響（±s）

表1 酸棗仁湯對(duì)老年REM睡眠剝奪大鼠大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01；與老年REM睡眠剝奪組比較，bP＜0.01

組別　　只數(shù)　　劑量／（g·kg）　　海馬 　　皮質(zhì)空白對(duì)照組　10　　等容31±8　33±10空白對(duì)照組　10　　等容　31±8　33±10空白對(duì)照組　10　　等容　31±8　33±10舒樂(lè)安定組　10　0.18×10-3　92±21b　101±32b酸棗仁湯低劑量組　10　12.96　45±12b　56±21b酸棗仁湯高劑量組　10　25.92　41±9b　52±16b

表2 酸棗仁湯對(duì)老年REM睡眠剝奪大鼠大腦皮質(zhì)、海馬部位Fos蛋白表達(dá)水平的影響（±s）

表2 酸棗仁湯對(duì)老年REM睡眠剝奪大鼠大腦皮質(zhì)、海馬部位Fos蛋白表達(dá)水平的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01；與老年REM睡眠剝奪組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別　　只數(shù)　　劑量／（g·kg）　海馬　　皮質(zhì)空白對(duì)照組　10　　等容23±6　27±7老年REM睡眠剝奪組　10　　等容　69±13a　71±11a舒樂(lè)安定組　10　0.18×10-3　58±8b　53±16c酸棗仁湯低劑量組　10　12.96　42±11c　39±11c酸棗仁湯高劑量組　10　25.92　39±9c　37±10c

3 討論

前期實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖復(fù)制亞急性衰老大鼠模型［3，8］，雖然自由基水平接近自然衰老大鼠，但是由于該衰老模型是由化學(xué)損傷造成的，難以真實(shí)反映衰老的生理生化改變，因此本課題改進(jìn)造模方法而選用自然老年24月齡W istar大鼠，采用國(guó)際上公認(rèn)的多平臺(tái)水環(huán)境法剝奪睡眠48 h，建立老年REM睡眠剝奪大鼠模型。

有研究表明，失眠對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用包括思維紊亂、反應(yīng)遲鈍、注意力分散、定向障礙以及學(xué)習(xí)記憶受損等，睡眠剝奪24 h可使人的認(rèn)知能力下降30%～40%，持續(xù)48 h，認(rèn)知能力下降則高達(dá)60%～70%［9-10］。原癌基因c-fos屬于立即早期基因，屬核內(nèi)蛋白類細(xì)胞癌基因，其特點(diǎn)是細(xì)胞外各種刺激均能誘導(dǎo)相應(yīng)的腦功能區(qū)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的c-fos原癌基因快速、短暫地表達(dá)［11］。它不但參與細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)分化、信息識(shí)別與傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等生理活動(dòng)，而且與動(dòng)物行為及多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且同動(dòng)物的清醒水平也有一定的關(guān)系［12］。原癌基因c-fos表達(dá)的核磷蛋白（Fos）被認(rèn)為是在外界刺激與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的信息傳導(dǎo)過(guò)程中起著核內(nèi)第三信使的作用［13］。

有報(bào)道睡眠剝奪可引起c-fos表達(dá)增加［14］，靈芝多糖可改善SD大鼠的空間記憶情況，這與降低海馬區(qū)c-fos表達(dá)有關(guān)［15］。因此本課題對(duì)cfos基因表達(dá)Fos蛋白指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，酸棗仁湯可能通過(guò)降低大腦c-fos基因表達(dá)水平、減少大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡而對(duì)老年失眠大鼠起到腦保護(hù)作用。結(jié)合課題前期酸棗仁湯的促眠實(shí)驗(yàn)以及檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，多角度表明酸棗仁湯可改善睡眠質(zhì)量、具有腦保護(hù)作用。

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Effect of Suanzao-Rentang on Neuronal Apoptosis and c-fos Gene Expression of Aged Rats with Rapid Eye Movement Sleep Deprivation

You Qiuyun，Wang Ping*，Zhang Shunbo，Huang Panpan，Zhang Chengpeng.*Pharmaceutical Institute，Hubei College of Traditional Chinese Medicine

ObjectiveTo observe the effect of Suanzao-Rentang on neuronal apoptosis and c-fos gene expression in Fos protein levels in cortex and hippocampus of aged ratswith rapid eyemovement（REM）sleep deprivation.MethodsNatural aging 24 months old W istar ratswere random ly divided into control group（isovolumetric saline），REM sleep deprivation elderly group（isovolumetric saline），positive control group estazolam 0.18mg／（kg·d），Suanzao-Rentang low and high dose group 12.96，25.92 g／（kg·d）.Each group was given intragastric administration for two weeks，then each group except the control group ismade REM sleep deprivation for 48h to producemodel of old rats with homemade improved multi-platform.The nerve cells apoptosis of cortex and hippocampus in the rats from each group are determ ined by situ end labeling（TUNEL）and level changes in c-fos gene expression to Fos protein are detected by using immunohistochem istry and explore the effect of suanzao-Rentang on the nerve damage and c-fos gene expression change in elder，which caused by insomnia.Resu lts Compared with the control group，the cerebral cortex and hippocampus nerve cells apoptosis of rats，which are from REM sleep deprivation group，increased，and their Fos protein expression was significantly.Compared with REM sleep deprivation older group，Suanzao-Rentang group’s nerve cells apoptosis and Fos protein expression in brain significantly decreased，but still higher than the normal control group.ConclusionC-fos gene is likely involved in the process of apoptosis in old REM sleep deprivation rats and Suanzao-Rentang inhibit neuronal apoptosis and play a protective role in the brain possibly by inhibiting brain upregulation of c-fos gene.

Elderly insomnia；Suanzao-Rentang；Model rats；Mechanism

國(guó)家自然科學(xué)基金（NO.81072849）

湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 （游秋云、張舜波、黃攀攀、章程鵬）；430065湖北中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局老年性癡呆醒腦益智重點(diǎn)研究室 （游秋云、王平）

王平，E-mail：pwang54＠aliyun.com