蛹蟲草大米培養(yǎng)基中多糖提取及初步純化工藝

陳小麗，鄭華章，涂玉佩，巫光宏*

（1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

蛹蟲草人工培養(yǎng)較為成功，其培養(yǎng)基中殘留有一定含量的多糖，將此多糖提取研究可提高培養(yǎng)基利用價值、節(jié)約資源。但是，大米、小麥等固體培養(yǎng)基中含有大量淀粉，而目前的多糖測定方法主要是通過定量總糖含量間接計算得到多糖含量[10-11]，大量淀粉會干擾對蛹蟲草多糖的測定，無法準(zhǔn)確計算多糖含量，現(xiàn)有研究卻大多未考慮這一問題[12-14]。為了準(zhǔn)確定量培養(yǎng)基中多糖含量，有必要先除去淀粉，再進行多糖的提取和測定。但是，如何在除去淀粉的同時盡量降低蛹蟲草多糖的損失率是一大難題。本研究探索了Ca（NO3）2法去除蛹蟲草大米培養(yǎng)基中大量的淀粉，然后采用水提法提取蛹蟲草多糖，為準(zhǔn)確定量蛹蟲草培養(yǎng)基多糖含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草子實體大米培養(yǎng)基：深圳澎源生物科技有限公司。

硝酸鈣：廣東臺山粵僑試劑塑料有限公司；氯仿：天津市大茂化學(xué)試劑廠；正丁醇：廣東光華化學(xué)廠有限公司；濃硫酸、可溶性淀粉：廣州化學(xué)試劑廠。以上試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；5810R高速冷凍離心機：德國EPPENDORF公司；TG16-WS高速離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；UV-1100分光光度計：青島紫泉儀器有限公司；AB104-N電子天平：梅特勒-托利多集團；60目試驗標(biāo)準(zhǔn)篩：浙江上虞市華康化驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 淀粉含量的測定方法[15-16]

淀粉含量的測定采用碘顯色法：淀粉與I2能特異性結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物，600 nm為碘與淀粉復(fù)合物的最大吸收波長。碘-碘化鉀溶液（I2-KI）用量影響顯色深度，隨用量增大，顯色加深，但并不呈線性增加，加入100 μL 0.2%I2-KI時獲得較好的結(jié)果。采用Ca（NO3）2提取淀粉時，其濃度對顯色有較大影響，本試驗需要對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ca（NO3）2去除淀粉進行正交試驗，因而分別作出不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ca（NO3）2溶解淀粉對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取梯度用量（0、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL）的淀粉溶液（0.01%），補加純水至4 mL，加入0.2%的I2-KI 100 μL，測定OD600nm，以其為橫坐標(biāo)，淀粉含量（mg/mL）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將淀粉分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、65%和80%的Ca（NO3）2溶解，同時用相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ca（NO3）2溶液補加至4 mL，按上述方法分別作出淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品淀粉含量計算公式如下：

對于一個接受英國教育，但是又長期生活、工作在印度，作品多取材自印度的作家來說，吉卜林不僅書寫了印度，也書寫了印度與英國之間的敏感關(guān)系，更多的是在殖民帝國時期的英國與印度的雙重社會文化語境下，訴說作為“英印人”的獨特的自我感受。

式中：X為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品淀粉質(zhì)量濃度，mg/mL；4為反應(yīng)體系總體積，mL；Vt為樣品總體積，mL；Vu為每支測定試管中加入的樣品體積，mL；M為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.2 淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗

稱取過60目篩的蛹蟲草培養(yǎng)基粉末2.0 g，加60 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇碾磨，離心，殘渣用60 mL蒸餾水懸浮洗滌一次，離心，去上清。所得殘渣按正交設(shè)計參數(shù)用Ca（NO3）2溶液懸浮，沸水浴10 min，4 000 r/min離心10 min，上清液透析除Ca（NO3）2，測定淀粉質(zhì)量，淀粉去除率計算公式如下：

式中：C1、C2分別為去除淀粉前和去除淀粉后樣品中淀粉質(zhì)量，mg。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以淀粉去除率為考察指標(biāo)，選取影響淀粉去除率的3個因素進行L9（34）正交試驗設(shè)計，淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗因素與水平見表1。

表1 淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for starch extraction condition optimization

在正交試驗基礎(chǔ)上，按上述試驗獲得的最優(yōu)方案追加淀粉去除試驗，提取淀粉4次，分別用碘顯色法測定每次提取所得溶液中淀粉的含量。提取4次之后的殘渣用于提取蟲草多糖，并測定粗提液中的淀粉含量，合并得淀粉總含量，計算淀粉去除率。

1.3.3 蛹蟲草多糖提取條件優(yōu)化正交試驗[17]

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響多糖提取率的4個因素進行正交試驗，因素與水平設(shè)計見表2。按1.3.2 最優(yōu)方案除去淀粉，所得殘渣按設(shè)計條件提取多糖，將提取液冷卻，10 000 r/min 離心10 min，上清液即為蛹蟲草多糖粗提液。苯酚-硫酸法[10]測定多糖含量，以多糖得率為考察指標(biāo)，確定最佳提取方案。多糖含量及得率計算公式如下：

多糖含量（mg）=（Ct-Cr）×0.9

式中：Ct為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的樣品總糖含量，mg；Cr為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的樣品還原糖含量，mg；0.9為校正系數(shù)。

式中：Cp為多糖含量，mg；M為樣品稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量，g；1 000為將mg轉(zhuǎn)換為g。

表2 多糖提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment for polysaccharides extraction conditions optimization

1.3.4 Sevag法除蛋白質(zhì)[18]

取10 mL醇析后復(fù)溶的蟲草多糖溶液，按1∶1、2∶1、3∶1體積比加入Sevag試劑（V氯仿/V正丁醇=2∶1），充分振蕩40 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍(lán)G250染色法），計算蛋白去除率和多糖損失率。

式中：Ca為脫蛋白前蛋白含量，mg/mL；Cb為脫蛋白后蛋白含量，mg/mL。

式中：Cp1為脫蛋白前多糖含量，mg/mL；Cp2為脫蛋白后多糖含量，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 碘顯色法測定淀粉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

淀粉用純水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、65%和80%的Ca（NO3）2溶液所作標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程分別為Y=0.147X，Y=0.097X，Y=0.095X，Y=0.084X，相關(guān)系數(shù)R2均為0.999，表明4條標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性都很高，可以分別用來計算相應(yīng)樣品中淀粉含量。

2.2 淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果表明，影響淀粉去除率的主次順序為提取次數(shù)＞Ca（NO3）2質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞料液比，直觀分析確定最佳組合為A3B1C3，即Ca（NO3）2質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20（g∶mL），提取3次，淀粉的去除率為42.57%。方差分析（表4）表明，Ca（NO3）2質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取次數(shù)對淀粉去除率的影響顯著。

表3 淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for starch removal condition optimization

表4 淀粉去除正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of the starch removal orthogonal result

2.3 多糖提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表5，極差分析表明，影響多糖提取率的主次順序為A（提取溫度）＞C（提取時間）＞D（提取次數(shù)）＞B（料液比）；正交試驗得出最優(yōu)組合為A3B1C3D2，即料液比為1∶30（g∶mL）、浸提溫度100 ℃、浸提3 h，提取2次，蛹蟲草水溶性多糖的提取率最高，可達(dá)3.31%。由表6可知，方差分析表明各個因素在α=0.05水平上影響均不顯著。

表5 蛹蟲草多糖提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiment for polysaccharides extraction conditions optimization

表6 多糖提取正交試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of the polysaccharides extraction orthogonal result

2.4 Sevag法除蛋白質(zhì)

圖1 不同比例的多糖溶液與Sevag試劑的除蛋白結(jié)果Fig.1 Deproteinization results of different ratio of polysaccharides solution and Sevag regent

從圖1可知，隨著Sevag試劑用量的增加蛋白的去除率增大而多糖的損失率降低。多糖溶液與Sevag試劑的比例為1∶3（V/V）時，除蛋白1次蛋白的去除率為94.2%，多糖的損失率為20.95%。

3 結(jié)論

本研究采用Ca（NO3）2提取法去除蛹蟲草培養(yǎng)基中的淀粉，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%Ca（NO3）2按料液比1∶20（g∶mL）在100 ℃條件下水浴10 min，重復(fù)3次，淀粉的去除率達(dá)42.57%。由于淀粉與蛹蟲草多糖的一些共性，采用一般方法分離二者較難，而采用本法浸提時間短，淀粉去除率高，同時可避免蟲草多糖的過多損失，具有較高實用價值。

在成功除掉大量淀粉的基礎(chǔ)上，進一步從培養(yǎng)基中提取蛹蟲草多糖，正交試驗表明，影響多糖提取率的主次順序為A（提取溫度）＞C（提取時間）＞D（提取次數(shù)）＞B（料液比）；正交試驗得出最優(yōu)試驗組合為A3B1C3D2，即料液比為1∶30（g∶mL）、浸提溫度100 ℃、浸提3 h，提取2次，提取率可達(dá)3.31%，通過單因素試驗確定最佳脫蛋白條件為多糖溶液與Sevag試劑按1∶3比例混合，除蛋白1次。此時，蛋白的去除率可達(dá)94.2%，而多糖損失率為20.95%，效果較好。

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