樺黃多糖提取工藝及抗氧化性研究

張麗華，劉 盼，趙 鵬 *，杜永鵬

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西麗彩集團(tuán)咸陽麗彩醫(yī)藥有限公司，陜西 咸陽 712000）

樺黃是多孔菌科滴孔菌屬植物樺滴孔菌Piptoporus betulinus（Bull.ex.fr）Karst的子實(shí)體[1]，具有消積、化疲、抗癌的功效，主要用于治療小兒食積、食管癌、胃癌、子宮癌、等。樺黃主要生長在海拔2 300 m以上病害的樺樹上，在秦嶺南北坡上均有發(fā)現(xiàn)，系陜西民間習(xí)用藥材。外觀為不規(guī)則塊狀物或呈瘤狀，無柄，表面有不規(guī)則的溝痕及深裂，斷面黃色。樺黃中主要含游離糖、糖醇、有機(jī)酸、甾醇等，藥理研究其具有一定的抗腫瘤活性[2-3]。多糖是中藥材中普遍存在的活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖血脂、抗衰老等藥理作用[4-6]，在保健食品和醫(yī)藥應(yīng)用等方面具有很廣的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。該試驗(yàn)優(yōu)化樺黃多糖的提取工藝，以便更好地開發(fā)和利用這一藥用資源，并初步研究了樺黃多糖的抗氧化性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水乙醇、乙醚、丙酮、濃硫酸、苯酚均為分析純：天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。

樺黃采自陜西省秦嶺山，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院宋逍副教授鑒定為樺黃中藥材。

1.2 儀器與設(shè)備

4K15臺(tái)式離心機(jī)：美國Sigma公司；UV-2501PC紫外可見分光光度儀：日本島津公司；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 樺黃多糖的提取工藝流程

圖1 樺黃多糖提取工藝流程Fig.1 Polysaccharide extraction process from P.betulinus

將樺黃藥材干燥至質(zhì)量恒定，粉碎，過60目篩。準(zhǔn)確稱取樺黃粉5 g，然后將其用無水乙醇進(jìn)行脫脂處理，按一定料液比加入水加熱提取，提取多次，合并提取液，抽濾、離心分離。濾液按生藥體積比1∶1濃縮后，加無水乙醇醇沉，靜置過夜，真空抽濾，真空干燥，可得樺黃粗多糖[7]。

1.3.2 提取工藝條件的選擇

采用單因素試驗(yàn)法優(yōu)化最佳提取工藝[8]。在提取樺黃多糖試驗(yàn)中，影響產(chǎn)品收率的因素很多，通過前期試驗(yàn)考察得出溫度、時(shí)間、液料比、提取次數(shù)等對多糖提取率的影響較大。

（1）提取溫度的選擇

準(zhǔn)確稱量粉碎好的樺黃，平行稱取5份，在液料比為10∶1（mL∶g），時(shí)間1 h，重復(fù)提取2次，在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃不同溫度條件下進(jìn)行樺黃多糖提取試驗(yàn)，提取液合并后濃縮，濃縮液再用5倍體積無水乙醇醇沉，研究不同的提取溫度對多糖提取率的影響。

（2）提取時(shí)間的選擇

準(zhǔn)確稱量粉碎好的樺黃，平行稱取5份，在液料比為10∶1（mL∶g），溫度為80 ℃，重復(fù)提取2次，在60 min、75 min、90 min、105 min、120 min不同時(shí)間條件下進(jìn)行樺黃多糖提取試驗(yàn)，提取液合并后濃縮，濃縮液再用5倍體積無水乙醇醇沉，研究不同的提取時(shí)間對多糖提取率的影響。

（3）液料比的選擇

準(zhǔn)確稱量粉碎好的樺黃，平行稱取5份，在溫度為80 ℃，提取時(shí)間105 min，重復(fù)提取2次，在9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1（mL∶g）不同液料比條件下進(jìn)行樺黃多糖提取試驗(yàn)，提取液合并后濃縮，濃縮液再用5倍體積無水乙醇醇沉，研究不同的液料比對多糖提取率的影響。

（4）提取次數(shù)的選擇

準(zhǔn)確稱量粉碎好的樺黃，平行稱取5份，在溫度為80 ℃，提取時(shí)間105 min，液料比16∶1（mL∶g），在1、2、3、4、5不同提取次數(shù)條件下進(jìn)行樺黃多糖提取試驗(yàn)，提取液濃縮，濃縮液再用5倍體積無水乙醇醇沉，研究不同的提取次數(shù)對多糖提取率的影響。

1.3.3 樺黃多糖含量及提取率計(jì)算

（1）多糖含量的測定

按照文獻(xiàn)[9-11]報(bào)道，多糖含量的測定應(yīng)用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=1.033 8C+0.020 5，R2=0.999 2。質(zhì)量濃度范圍在0.08～1.00 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

（2）多糖提取率計(jì)算

準(zhǔn)確稱量粗多糖，配制溶液，依照苯酚硫酸顯色方法顯色，測量吸光度值，計(jì)算多糖提取率。

1.3.4 樺黃多糖對DPPH·的清除作用[12]

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可見光區(qū)最大吸收峰為517 nm，當(dāng)DPPH·溶液中加入自由基清除劑后，DPPH·溶液顏色變淺，可以用于評價(jià)自由基清除劑清除自由基的能力，DPPH·清除率計(jì)算公式：

式中：A空白為1.0 mL DPPH·溶液+1.0 mL 無水乙醇吸光度值；A樣品為1.0 mL多糖溶液+1.0 mL DPPH·溶液吸光度值；A對照為1.0 mL多糖溶液+1.0 mL無水乙醇溶液吸光度值。

配制1×10-4mol/L的DPPH溶液，配制不同質(zhì)量濃度多糖溶液，分別吸取待測多糖溶液1.0 mL，加入DPPH·溶液1.0 mL，混合均勻，在暗處放置30 min。以無水乙醇為空白，測定波長517 nm處的吸光度值，得到A樣品。按上述要求再分別測得A空白和A對照，帶入式（2）中，計(jì)算不同質(zhì)量濃度條件下樺黃多糖對DPPH·的清除率。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對多糖提取率的影響

圖2 溫度對樺黃多糖提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on P.betulinus polysaccharide extraction rate

圖2表明，當(dāng)操作溫度＜80 ℃時(shí)，多糖的提取率快速增加，當(dāng)提取溫度＞80 ℃時(shí)，提取率逐漸呈下降趨勢，因此確定最佳提取溫度為80 ℃。

2.1.2 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

圖3 時(shí)間對樺黃多糖提取率的影響Fig.3 Effect of time on P.betulinus polysaccharide extraction rate

圖3表明，當(dāng)提取時(shí)間在60～105 min之間時(shí)，多糖的提取率快速增大，＞105 min則改變不大，此時(shí)多糖的提取率隨著時(shí)間的增加變化很小，因此選擇提取時(shí)間為105 min。

2.1.3 液料比對多糖提取率的影響

圖4 液料比對樺黃多糖提取率的影響Fig.4 Effect of liquid solid ratio on P.betulinus polysaccharide extraction rate

圖4表明，液料比在達(dá)到12∶1（mL∶g）之前，多糖提取率增幅較大，超過12∶1（mL∶g）之后則變化不大，此時(shí)絕大部分多糖已經(jīng)被溶出，因此選擇液料比為12∶1（mL∶g）左右。

2.1.4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響

圖5 提取次數(shù)對樺黃多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction times on P.betulinus polysaccharide extraction rate

圖5表明，提取次數(shù)＞2次時(shí)，多糖提取率曲線變化趨勢已趨于平緩，為了減少后期濃縮的困難以及從節(jié)約能源的角度考慮，選擇提取次數(shù)2次較為理想。

2.2 最優(yōu)提取工藝條件

單因素優(yōu)化試驗(yàn)確定水提法提取樺黃多糖的最優(yōu)提取工藝為水液比12∶1，溫度80 ℃，時(shí)間105 min，提取2次。按照此工藝重復(fù)操作3次，提取的樺黃多糖的平均含量為65 mg/g。

2.3 樺黃多糖的抗氧化性研究

如圖6所示，樺黃多糖對DPPH·的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率呈上升趨勢，在4.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最大，為92.02%。多糖質(zhì)量濃度繼續(xù)增大對DPPH·的清除率基本變化不大，說明樺黃多糖對DPPH·具有一定的清除性，并且隨著多糖質(zhì)量濃度增加，抗氧化性增強(qiáng)。樺黃多糖具有一定的抗氧化性，需要進(jìn)一步深入研究。

圖6 不同質(zhì)量濃度的樺黃多糖對清除DPPH影響Fig.6 Effect of different concentration of P.betulinus polysaccharide on DPPH scavenging activity

3 結(jié)論

對樺黃多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，最終得到了樺黃多糖提取最佳工藝為提取溫度80 ℃，提取時(shí)間105 min，液料比12∶1（mL∶g），提取2次。在此工藝條件下，重復(fù)操作，樺黃多糖的平均含量為65 mg/g；對樺黃多糖進(jìn)行了抗氧化性研究，結(jié)果表明，樺黃多糖對自由基DPPH·具有一定的清除作用。本研究結(jié)果對樺黃多糖分離純化以及結(jié)構(gòu)解析、藥理活性等進(jìn)一步研究具有一定的參考價(jià)值。

[1]趙繼鼎，徐連旺，張小青.中國多孔菌科分類系統(tǒng)的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，1982，22（3）：218-232.

[2]喬蓉霞，張國躍，郭耀武，等.樺黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2011，13（8）：1450-1451.

[3]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（2010 年版.一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[4]丁寶金，金麗琴，呂建新.多糖的生物活性研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，2004，39（8）：561-569.

[5]郭天力，嚴(yán)曉娟，胡先望，等.真菌多糖研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（18）：3578-3583.

[6]翁 梁，溫 魯.藥用真菌多糖研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2008，29（12）：748-751.

[7]林 曉，潘文嘉.靈芝多糖抗皮膚衰老作用研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（9）：174-175.

[8]苗元振，張紅燕，薛宏偉，等.食藥用真菌多糖抗氧化作用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)（增刊），2008（S1）：30-33.

[9]賈亮亮，袁 丁，何毓敏，等.多糖提取分離及含量測定的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（3）：189-192.

[10]王永斌，王允祥.雷蘑胞外多糖分離提取工藝優(yōu)化研究[J].中國釀造，2007，26（5）：32-37.

[11]馬 鶯，王 靜，牛天驕.功能性食品活性成分測定[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[12]劉源才，孫細(xì)珍，許 銀.枸杞多糖組成及含量測定方法的改進(jìn)[J].食品科學(xué)，2013，34（12）：292-295.

[13]趙豐麗，張?jiān)气?，寧良丹，?紅菇多糖的提取分離及其抗氧化活性的研究[J].中國釀造，2009，28（11）：98-101.

[14]侯秀娟，沈勇根，徐明生，等.化橘紅多糖的提取純化及抗氧化活性研究[J].中國釀造，2012，31（9）：135-138.

[15]俞慧紅，竺巧玲，戴 飛，等.多糖抗氧化作用的研究現(xiàn)狀[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：172-176.