小麥抗性淀粉含量測定方法研究

游倩倩，黃繼紅，2*，馮軍偉，蘇雪鋒，王 文，楊銘乾

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所，河南 鄭州 450003）

0 前言

抗性淀粉（resistant starch，RS）的概念由英國生理學(xué)家Englyst 于1982 年提出，1993 年歐洲抗性淀粉協(xié)會（EURESTA）將其定義為“健康者小腸中不被吸收的淀粉及其降解產(chǎn)物的總稱”.抗性淀粉能降低胰島素反應(yīng)，對II 型糖尿病有緩解作用[1-3]，調(diào)節(jié)機(jī)體能量攝入，控制體質(zhì)量[4-5]，因此在人類健康飲食的研究和生產(chǎn)中具有廣闊前景.世界衛(wèi)生組織等機(jī)構(gòu)1998 年聯(lián)合出版的《人類營養(yǎng)中的碳水化合物》一書中指出：“抗性淀粉的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展，是近年來碳水化合物與健康關(guān)系的研究中的一項重要成果.”

抗性淀粉檢測目前尚無國標(biāo)，檢測方法有一定差異，主要有體內(nèi)法和體外法，體內(nèi)測定法是用活體腸道消化樣品然后測定未消化的淀粉含量，這種方法費時、成本高，不適合大量樣品的測定，同時有研究發(fā)現(xiàn)人體本身的年齡、生理狀況及生活環(huán)境也會造成淀粉消化能力的差異，因此目前的抗性淀粉測定方法以體外法為主.體外測定法的基本原理大多是使用α-淀粉酶水解樣品，再直接測定殘余物中未分解的淀粉量，或通過測定樣品總淀粉和可消化淀粉的含量，以兩者差值表示抗性淀粉含量.α-淀粉酶種類廣泛，包括胰α-淀粉酶、中溫α-淀粉酶和耐高溫α-淀粉酶，作者通過使用不同種類α-淀粉酶對比測定效果，同時考慮抗性淀粉中蛋白質(zhì)的影響，確定小麥抗性淀粉測定的最佳方法.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

小麥淀粉：河南省天存小麥改良技術(shù)研究所；國民淀粉260：國民淀粉工業(yè)（上海）有限公司；普通胃蛋白酶：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；耐高溫α-淀粉酶、普魯蘭酶：財鑫集團(tuán)；中溫α-淀粉酶：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；豬胰腺α-淀粉酶：sigma 公司；抗性淀粉試劑盒：愛爾蘭Megazyme 公司；3，5-二硝基水楊酸、順丁烯二酸均為化學(xué)純；無水葡萄糖、無水乙醇、迭氮鈉、氫氧化鉀、冰醋酸、氫氧化鈉、二水氯化鈣均為分析純.

1.2 主要儀器和設(shè)備

LDZX-50FB 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；GZX-GF-MBS-1（9053A）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FA1204B 電子天平、723N 可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHA-C 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：金壇華峰儀器有限公司；TDZ5-WS 湘儀離心機(jī)：河南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；TH-500 梯度混合器：上海滬西分析儀器廠；XL-30-ESEM 環(huán)境掃描電子顯微鏡：荷蘭菲利普電子光學(xué)有限公司.

1.3 方法

1.3.1 小麥抗性淀粉制備方法

酶-壓熱法制備小麥抗性淀粉：稱取一定量的小麥淀粉，加適量水混勻后加入耐高溫α-淀粉酶，沸水浴10 min，取出后冷卻，加入適量水和普魯蘭酶，50～60 ℃酶解過夜，放入高壓蒸汽滅菌器，高溫高壓（121 ℃）處理一定時間，取出后自然冷卻，低溫（4 ℃）放置過夜，60 ℃鼓風(fēng)干燥，粉碎.

1.3.2 Goni 法

稱取100 mg 待測樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL KCl-HCl 緩沖液，再加胃蛋白酶溶液，充分混合，在40 ℃下水浴振蕩60 min，冷卻后加入9 mL Tris-maleate 緩沖液和胰α-淀粉酶溶液，充分混合，37 ℃下水浴振蕩16 h，離心（3 000 r/min，15 min），去除上清液，用蒸餾水洗滌后，再次離心，去除上清液.所得沉淀用3 mL 蒸餾水潤濕，加3 mL 4 mol/L KOH 溶液混合，室溫振蕩30 min，再加5.5 mL 2 mol/L HCl 和3 mL 0.4 mol/L 醋酸鈉緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH 至4.75，加葡萄糖淀粉酶溶液，混合，60 ℃水浴振蕩45 min，離心（3 000 r/min，15 min），收集上清液于容量瓶中，用10 mL 蒸餾水洗滌沉淀，離心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，合并上清液，用水定容至50 mL.DNS 法測定葡萄糖含量，RS 含量=葡萄糖含量×0.9.

1.3.3 AOAC 法[6]

AOAC Official Method 2002.02.

1.3.4 中溫α-淀粉酶法

稱取100 mg 待測樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL KCl-HCl 緩沖液，再加胃蛋白酶溶液，充分混合，在40 ℃下水浴振蕩60 min，冷卻后加入9 mL Tris-maleate 緩沖液和中溫α-淀粉酶溶液，充分混合，60 ℃下水浴振蕩10 h，離心（3 000 r/min，15 min），去除上清液，用蒸餾水洗滌后，再次離心，去除上清液.所得沉淀用3 mL 蒸餾水潤濕，加3 mL 4 mol/L KOH 溶液混合，室溫振蕩30 min，再加5.5 mL 2 mol/L HCl 和3 mL 0.4 mol/L 醋酸鈉緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH 至4.75，加葡萄糖淀粉酶溶液，混合，60 ℃水浴振蕩45 min，離心（3 000 r/min，15 min），收集上清液于容量瓶中，用10 mL 蒸餾水洗滌沉淀，離心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，合并上清液，用水定容至50 mL.用GOPOD 試劑測定D-葡萄糖的含量.

1.3.5 耐高溫α-淀粉酶法

稱取100 mg 待測樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL KCl-HCl 緩沖液，再加胃蛋白酶溶液，充分混合，在40 ℃下水浴振蕩60 min，冷卻后加入9 mL 磷酸氫二鈉緩沖液和耐高溫α-淀粉酶溶液，充分混合，100 ℃下恒溫振蕩30 min，冷卻至室溫，調(diào)整pH 后加入葡萄糖淀粉酶，60 ℃水浴振蕩60 min，冷卻離心（3 000 r/min，15 min），去除上清液，用蒸餾水洗滌后，再次離心，去除上清液.所得沉淀用3 mL 蒸餾水潤濕，加3 mL 4 mol/L KOH 溶液混合，室溫振蕩30 min，再加5.5 mL 2 mol/L HCl 和3 mL 0.4 mol/L 醋酸鈉緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH至4.75，加葡萄糖淀粉酶溶液，混合，60 ℃水浴振蕩45 min，離心（3 000 r/min，15 min），收集上清液于容量瓶中，用10 mL 蒸餾水洗滌沉淀，離心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，合并上清液，用水定容至50 mL.用GOPOD 試劑測定D-葡萄糖的含量.

1.3.6 小麥淀粉與小麥抗性淀粉的微觀形貌比較

將烘干的待測樣品研碎，然后均勻分散于雙面膠上并固定在銅臺上，噴金后進(jìn)行掃描電鏡觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同測定方法測定不同種類淀粉抗性淀粉的含量（表1）

表1 不同測定方法對不同樣品的測定結(jié)果

Goni 法和AOAC 法均采用胰α-淀粉酶37 ℃酶解，Goni 法在淀粉酶酶解前有蛋白質(zhì)酶解過程，模擬了人體消化的過程，消除了淀粉中的蛋白質(zhì)對淀粉酶水解淀粉的影響，而AOAC 法在淀粉酶中添加了糖苷酶，避免淀粉水解產(chǎn)物（如麥芽糖、麥芽三糖）對胰α-淀粉酶活性的抑制，從兩者的結(jié)果上看AOAC 法中胰α-淀粉酶的作用發(fā)揮更為有效，并且去除了胃蛋白酶消化過程，修改了一些參數(shù)，測定更為簡便，在葡萄糖的檢測方法上，Goni法采用DNS 法，AOAC 法中采用GOPOD 法，其中GOPOD 法又分為對RS 含量在10%以下和10%以上的不同計算公式，從小麥淀粉的RS 測定結(jié)果可以看出AOAC 法更為精確.

采用中溫α-淀粉酶比胰α-淀粉酶酶解時間有所減少，試驗中將中溫α-淀粉酶法又分為有蛋白酶酶解過程和無蛋白酶酶解兩個過程，可以看出蛋白質(zhì)對測定結(jié)果有影響，但是，國民淀粉260和小麥淀粉有蛋白質(zhì)酶解過程的RS 測定結(jié)果相對于無蛋白質(zhì)酶解過程偏高，而試劑盒標(biāo)樣和小麥抗性淀粉有蛋白質(zhì)酶解過程的RS 測定結(jié)果相對于無蛋白質(zhì)酶解過程則偏低.

耐高溫α-淀粉酶法在測定時間上更具優(yōu)勢，淀粉酶酶解時間只需30 min.測定試驗也分為有蛋白酶酶解過程和無蛋白酶酶解兩個過程，從測定結(jié)果看蛋白質(zhì)對測定結(jié)果有影響，并且不同種類淀粉有蛋白質(zhì)酶解過程的RS 測定結(jié)果相對于無蛋白質(zhì)酶解過程均偏高.

2.2 方法的穩(wěn)定性分析（表2）

表2 對小麥抗性淀粉淀粉不同測定方法重復(fù)性比較

由表2 可以看出，測定小麥抗性淀粉含量穩(wěn)定性最好、精密度最高的是AOAC 法，Goni 法次之；其他測定方法中，無蛋白酶消化過程的重復(fù)性優(yōu)于有蛋白酶消化過程，這是由于抗性淀粉測定的精細(xì)要求，多個步驟就會對測定重復(fù)性造成一定影響.

2.3 小麥淀粉與小麥抗性淀粉的微觀形貌比較

小麥淀粉和小麥抗性淀粉的電鏡照片見圖1和圖2.

圖1 和圖2 顯示，小麥淀粉顆粒較完整，表面光滑，而通過酶解壓熱法制備的小麥抗性淀粉顆粒形狀已經(jīng)被破壞，形成不規(guī)則形狀，表面不光滑且有一些褶皺和溝壑，從而具有了一定的抗酶解性.表1 中顯示小麥抗性淀粉的測定結(jié)果隨著酶解溫度的提高而降低，推測是由于小麥抗性淀粉的這種不規(guī)則結(jié)構(gòu)使其抗酶解性只在一定溫度范圍內(nèi)有效，隨著溫度升高，其抗酶解性下降.

圖1 小麥淀粉電鏡照片

圖2 小麥抗性淀粉電鏡照片

3 結(jié)論

對小麥抗性淀粉的RS 測定，Goni 法和AOAC法的測定結(jié)果最高，其他方法推測是由于溫度的影響從而使得結(jié)果偏低，而Goni 法和AOAC 法最接近人體消化過程，因此Goni 法和AOAC 法都可用于酶解壓熱后小麥淀粉的RS 測定.測定重復(fù)性也是Goni 法和AOAC 法最好，而AOAC 法又高于Goni 法，因此，AOAC 法是測定小麥抗性淀粉的首選方法.但是由于對抗性淀粉的測定方法研究較少，究竟哪種方法測量的結(jié)果比較準(zhǔn)確，還要通過體內(nèi)試驗來驗證.

［1］Dundas S M.The effect of resistant starch on metabolic indices of type II diabetes［D］.Canada:University of Guelph，2010.

［2］Bodinham C L，Smith L，Wright J W，et al.The effects of resistant starch on appetite，food intake and insulin［J］.The Proceedings of the Nutrition Society，2011，70:1.

［3］Hasjim J，Lee S，Hendrich S，et al.Characterization of a novel resistant-starch and its effects on postprandial plasma -glucose and insulin responses［J］.Cereal Chemistry，2010，87（4）:257-262.

［4］Al-Mana N，Robertson M D.The acute effects of resistant starch on appetite and satiety in overweight individuals［J］.The Proceedings of the Nutrition Society，2012，71:1.

［5］Zhou J，Martin R J，Tulley R T，et al.Failure to ferment dietary resistant starch in specific mouse models of obesity results in no body fat loss［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（19）:8844-8851.

［6］45.4.15.AOAC Official Method 2002.02，Resistant starch in starch and plant materials enzymatic digestion［S］.