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    養(yǎng)陰活血合劑對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的腎保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制研究

    2014-04-18 06:12:28周婷屈長(zhǎng)宏蔣紅心廖建春茆俊卿劉曉靜黃萍
    江蘇中醫(yī)藥 2014年11期
    關(guān)鍵詞:養(yǎng)陰合劑活血

    周婷 屈長(zhǎng)宏 蔣紅心 廖建春 茆俊卿 劉曉靜 黃萍

    (揚(yáng)州市中醫(yī)院,江蘇揚(yáng)州 225002)

    養(yǎng)陰活血合劑對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的腎保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制研究

    周婷 屈長(zhǎng)宏 蔣紅心 廖建春 茆俊卿 劉曉靜 黃萍

    (揚(yáng)州市中醫(yī)院,江蘇揚(yáng)州 225002)

    目的:觀察中藥養(yǎng)陰活血合劑對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腎損害的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法:將20只12周齡的雄性SHR大鼠隨機(jī)分為SHR組、中藥組、安博維組和聯(lián)合組,每組5只,同時(shí)設(shè)5只同齡Wistar-Kyoto(WKY)大鼠作為正常對(duì)照組。中藥組和安博維組分別予養(yǎng)陰活血合劑(等效劑量為每日15g/kg)和安博維(等效劑量為每日30mg/kg)灌胃,每日1次;聯(lián)合組則給予養(yǎng)陰活血合劑加安博維灌胃,每日1次;SHR組和正常對(duì)照組均給予等量的蒸餾水每日1次灌胃。共治療及喂養(yǎng)8周,監(jiān)測(cè)尾動(dòng)脈血壓。在實(shí)驗(yàn)開始給藥前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取小便標(biāo)本及血標(biāo)本,檢測(cè)尿β2-微球蛋白(β2-MG)和尿微量白蛋白(mALB)及血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)。采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)mRNA和內(nèi)皮素1(ET-1)mRNA的表達(dá)。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)前SHR各組血壓均顯著高于WKY組;實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前相比,中藥組、安博維組和聯(lián)合組大鼠血壓均明顯下降。實(shí)驗(yàn)后SHR組大鼠尿mALB、β2-MG較實(shí)驗(yàn)前明顯升高,中藥組、安博維組則明顯下降,聯(lián)合組下降更明顯。實(shí)驗(yàn)后中藥組、安博維組及聯(lián)合組大鼠尿mALB、β2-MG均明顯低于SHR組。與SHR組相比,中藥組、安博維組、聯(lián)合組腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達(dá)均顯著下降。結(jié)論:養(yǎng)陰活血合劑可降低SHR大鼠血壓,降低尿微量蛋白,其腎保護(hù)作用機(jī)制可能與其下調(diào)腎組織TGF-β1mRNA和ET-1mRNA表達(dá)的功能有關(guān)。

    養(yǎng)陰活血合劑 自發(fā)性高血壓 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1內(nèi)皮素-1 實(shí)驗(yàn)研究

    近年來,隨著高血壓的發(fā)病率逐漸增高,對(duì)于高血壓引起的腎損害越來越受到人們的重視。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)高血壓早期腎臟就已出現(xiàn)了異常改變,因此對(duì)于高血壓引起的腎損害的早期診斷和早期治療就顯得頗為重要。我們前期研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)陰活血合劑對(duì)高血壓早期腎損害患者具有顯著的療效,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究養(yǎng)陰活血合劑對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠早期腎損害的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)20只,Wistar-Kyoto(WKY)大鼠5只,SPF級(jí),雄性,12周齡,平均體重(280±20)g,均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

    1.2 藥物養(yǎng)陰活血合劑由熟地黃15g、山茱萸15g、何首烏15g、枸杞子15g、丹參15g、川芎10g、水蛭10g、川牛膝10g、澤蘭10g、天麻10g、鉤藤10g、丹皮10g組成,由揚(yáng)州市中醫(yī)院制劑室煎制,煎制成濃度1.5g/mL的藥液。安博維(厄貝沙坦),150mg/片,杭州賽諾菲安萬民生制藥有限公司生產(chǎn)。

    1.3 試劑與儀器Trizilo試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司);PCR試劑和TaqDNA聚合酶(美國(guó)Fermentas公司);瓊脂糖凝膠(英國(guó)OSOID公司);DNA Marker(美國(guó)Fermentas公司);10mg/mL溴化乙錠(美國(guó)Sigma公司);美國(guó)ABI17900實(shí)時(shí)定量PCR儀;DSWY-1大鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量裝置(上海欣曼科教設(shè)備有限公司);RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠);全自動(dòng)生化分析儀(西班牙DIAGNOSTIC);低速離心機(jī)(日立7060型,日本日立公司);超低溫冰箱(SANYOMDF-U71V型,日本)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 分組與給藥25只大鼠予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,將20只SHR大鼠隨機(jī)分為SHR組、中藥組、安博維組和聯(lián)合組,每組5只,另取5只同齡WKY大鼠作為正常對(duì)照組。中藥組予以養(yǎng)陰活血合劑灌胃,每日1次,根據(jù)大鼠與人的體表面積比例,按人每公斤體重的臨床日用量折算大鼠的等效劑量,大鼠中藥等效劑量為15g/(kg·d)。安博維組給予安博維灌胃,每日1次,安博維的等效劑量為30mg/(kg·d)。聯(lián)合組則給予養(yǎng)陰活血合劑加安博維灌胃,每日1次。正常對(duì)照組和SHR組均給予等量蒸餾水每日1次灌胃。各組均治療并喂養(yǎng)8周。

    2.2 血壓測(cè)量測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓,實(shí)驗(yàn)前測(cè)1次,實(shí)驗(yàn)后第1、2周各測(cè)血壓1次,以后每隔2周測(cè)血壓并記錄,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每記錄1次測(cè)血壓3次,取均值。

    2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)開始給藥前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天清晨留取小便標(biāo)本,采用放射免疫法檢測(cè)尿β2-微球蛋白(β2-MG)和尿微量白蛋白(mALB)含量。在實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取血標(biāo)本1mL,用以檢測(cè)血尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)。

    2.4檢測(cè)大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)mRNA和內(nèi)皮素1(ET-1)mRNA的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chainreaction,RT-PCR)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。斷頭處死大鼠后,迅速取腎臟,Trizol試劑提取總RNA,然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。內(nèi)參照引物(Gapdh)上游引物:ACTTTGGCATCGTGGAAGGG,下游引物:ACTTGGCAGGTTTCTCCAGG;TGF-β1上游引物:AGGGCTACCATGCCAACTTC,下游引物:CCACGTAGTAG ACGATGGGC;ET-1上游引物:ATCAGAGCAACCAGACA CCG,下游引物:TGCACTTCCTTCTCAGCTCG。PCR反應(yīng)體系25μL,含2μL DNA模板,上游引物及下游引物(10μmol/μL)各1μL,12.5μL SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ,8.5μL滅菌蒸餾水。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s;95℃5s、60℃30s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束檢測(cè)熒光信號(hào)。隨后是一個(gè)緩慢升溫的程序,同時(shí)連續(xù)檢測(cè)DNA產(chǎn)物的溶解曲線,以了解樣品擴(kuò)增的特異性,保障測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。然后用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析,相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn),P<0.05示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尾動(dòng)脈血壓比較實(shí)驗(yàn)前SHR大鼠各組血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但均顯著高于正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前相比,中藥組大鼠血壓顯著下降(P<0.05),安博維組和聯(lián)合組下降更顯著(P<0.001),提示中藥養(yǎng)陰活血合劑有一定的降壓作用。見表1。

    3.2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后腎功能比較實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠BUN、Scr含量比較均無明顯差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)后SHR組mALB、β2-MG較實(shí)驗(yàn)前明顯升高(P<0.01),中藥組、安博維組則明顯下降(P<0.05),聯(lián)合組下降更明顯(P<0.01);實(shí)驗(yàn)后中藥組、安博維組及聯(lián)合組尿mALB、β2-MG明顯低于SHR組(P<0.01)。見表2。

    3.3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)后腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA表達(dá)比較與SHR組相比,中藥組、安博維組、聯(lián)合組大鼠腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達(dá)均顯著下降(P<0.05或P<0.01)。見表3。

    4 討論

    高血壓病腎臟損害的病理表現(xiàn)主要為腎小動(dòng)脈硬化,入球小動(dòng)脈、小葉間動(dòng)脈玻璃樣變性和間質(zhì)纖維化,其中腎間質(zhì)纖維化是高血壓病腎臟損害的重要病理基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在腎間質(zhì)纖維化過程中起到重要的作用。TGF-β1可促進(jìn)ECM蛋白的生成和沉積,降低蛋白酶的生成而減少基質(zhì)降解[1],可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞肥大;使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,成為肌成纖維細(xì)胞;促進(jìn)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致腎小管萎縮、腎功能損害[2]。王甜等[3]研究發(fā)現(xiàn),SHR大鼠腎臟組織TGF-β的表達(dá)隨周齡和血壓的增加而升高,與β2-MG的變化趨勢(shì)一致,可以作為早期腎損害的診斷指標(biāo)。ET-1是參與了高血壓腎損害的另外一種重要的因子,是血管強(qiáng)力收縮劑,可顯著減少腎臟血流量(RBF)和腎小球?yàn)V過率(GFR)。ET-1還可促使腎臟血管平滑肌細(xì)胞的增生,腎小球系膜細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)腎小球硬化的形成與發(fā)展,加重高血壓時(shí)腎功能損害的程度。有研究發(fā)現(xiàn),16個(gè)月齡的自發(fā)性高血壓大鼠存在明顯的腎損害,血漿和腎組織中的ET含量也明顯升高,提示ET可能參與了SHR的腎損害[4]。

    高血壓早期腎損害階段,腎臟沒有明顯的結(jié)構(gòu)和功能改變,缺少相關(guān)的臨床癥狀和體征,尿素氮和肌酐在早期不能反映腎小球的濾過功能,用常規(guī)的檢測(cè)方法難以較早判斷腎臟損害情況。而尿mALB在腎小球輕度受損時(shí)即明顯升高,標(biāo)志著腎小球?yàn)V過膜電荷選擇性屏障損傷,是腎小球早期損害的敏感指標(biāo)。β2-MG是體內(nèi)所有有核細(xì)胞的固有成分,幾乎全部由腎小球?yàn)V過,99%被腎小管重吸收,是判斷腎小管、腎間質(zhì)損害的敏感指標(biāo)。尿mALB和β2-MG聯(lián)合檢測(cè)可以早期發(fā)現(xiàn)腎臟損害。本實(shí)驗(yàn)證實(shí),SHR大鼠在13周時(shí)即有尿mALB、和β2-MG的顯著升高,且隨著周齡的增加而升高(P<0.01)。

    中醫(yī)認(rèn)為高血壓早期腎損害病位主要在肝腎兩臟,以肝腎陰虛、肝陽上亢為主要病理基礎(chǔ),瘀血為主要病理因素?!秲?nèi)經(jīng)·素問》云:“腎者主水,受五臟六腑之精而藏之”,“腎者,主蟄,封藏之本,精之處也”。腎虛,封藏失司,不能固澀精微,致精微外泄;肝腎陰虛,脈道失濡,血行不暢,腎絡(luò)瘀阻,且“久病必瘀”,瘀阻腎絡(luò),清濁不分,精微壅而外溢,皆可出現(xiàn)尿mALB、β2-MG升高等高血壓早期腎損害的表現(xiàn)。據(jù)此理論,中醫(yī)治療立法以養(yǎng)陰活血為主,方中熟地黃、山茱萸、何首烏、枸杞子補(bǔ)肝腎,益精血,固澀精微;丹參、水蛭、川芎、丹皮、川牛膝活血化瘀通絡(luò),川牛膝又引藥下行,丹皮兼清肝熱;天麻、鉤藤平息肝陽;澤蘭活血利水。全方共奏養(yǎng)陰活血、固攝精微之功效。前期研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)陰活血合劑可顯著降低高血壓合并早期腎損害患者的尿mALB、β2-MG和24h尿蛋白[5-6]。本研究通過養(yǎng)陰活血合劑治療自發(fā)性高血壓大鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),養(yǎng)陰活血合劑能降低SHR大鼠的血壓,顯著降低尿mALB和尿β2-MG,具有保護(hù)高血壓腎臟損害的作用,安博維與養(yǎng)陰活血合劑合用則有協(xié)同作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)陰活血合劑和安博維都可顯著抑制SHR大鼠腎臟組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達(dá),兩者合用則作用更明顯,顯示養(yǎng)陰活血合劑可通過抑制腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達(dá),進(jìn)而抑制高血壓引起的腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化,從而起到腎保護(hù)的作用。

    表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尾動(dòng)脈血壓比較(±s)mmHg

    表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尾動(dòng)脈血壓比較(±s)mmHg

    注:與本組0周時(shí)比較,△P<0.05,△△△P<0.001;與同時(shí)期SHR組比較,▲P<0.05,▲▲▲P<0.001。

    組別動(dòng)物數(shù)(只)0周8周正常對(duì)照組5108.6±8.050110.6±7.335 5177.2±11.17中藥組5177.0±8.436154.4±6.044△▲安博維組5177.5±9.678118.0±11.76△△△▲▲▲聯(lián)合組5174.8±8.402106.0±6.356△△△▲▲▲SHR組171.2±2.588

    表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尿微量白蛋白、β2微球蛋白、尿素氮及肌酐比較(±s)

    表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尿微量白蛋白、β2微球蛋白、尿素氮及肌酐比較(±s)

    注:與本組實(shí)驗(yàn)前比較,*P<0.05,**P<0.01;與同時(shí)期SHR組比較,##P<0.01。

    組別動(dòng)物數(shù)(只)正常對(duì)照組5 BUN(mmol/L)實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)前6.2±1.5 6.5±2.852.6±8.1 68.2±7.1**54.8±7.386.4±5.9**中藥組56.4±1.7 7.6±3.155.8±3.6 59.0±7.536.9±4.628.5±5.7*##56.1±6.243.2±9.3*##安博維組57.2±1.1 7.0±2.560.3±5.7 62.5±5.340.1±3.527.3±8.0*##52.7±5.839.5±8.7*##聯(lián)合組56.7±2.6 7.4±1.658.9±7.2 63.8±6.139.5±4.315.4±5.6**##56.8±8.129.3±6.4**##實(shí)驗(yàn)前12.4±3.2 β2-MG(μg/L)實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后5.9±2.46.3±3.1 6.8±3.0 8.5±2.453.5±5.4 67.2±2.138.7±5.2 Scr(μmol/L)實(shí)驗(yàn)后58.5±9.4 mALB(mg/L)實(shí)驗(yàn)后15.1±2.6 SHR組5

    表3 各組TGF-β1和ET-1mRNA表達(dá)的變化(2-ΔΔCt)

    [1]Schnaper H,Hayashida T,Hubchak SC,et al.TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis.Am JPhysiol Renal Physiol,2003,283(2):243

    [2]Li JH,Huang XR,Zhu HJ,et al.Role of TGF-beta signaling in extracellular matrix productionnunder high glucose conditions. Kidney Int,2003,63(6):2010

    [3]王甜,李靜,時(shí)曄,等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在自發(fā)性高血壓大鼠腎臟的增齡性變化.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2012,41(8):952

    [4]王小丹,鄭秋甫,谷慶陽,等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮素在自發(fā)性高血壓大鼠腎損害中的作用.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2000,25(4):270

    [5]周婷.中西藥合用治療高血壓病早期腎損害療效研究.遼寧中醫(yī)雜志,2008,35(2):256

    [6]周婷,屈長(zhǎng)宏.養(yǎng)陰活血方聯(lián)合安博維治療高血壓病早期腎損害患者30例.中醫(yī)雜志,2009,50(11):1009

    R544.105

    A

    1672-397X(2014)11-0077-03

    周婷(1963-),女,本科學(xué)歷,主任中醫(yī)師,主要從事腎臟疾病的中西醫(yī)結(jié)合診治研究。Yzzt11757@163.com

    2014-05-26

    編輯:吳寧

    江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目(LZ11168)

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