腎安顆粒對腎性骨病模型大鼠骨組織骨保護素表達的影響

鄒新蓉 王小琴 王長江 袁軍 朱守志

（湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061）

腎安顆粒對腎性骨病模型大鼠骨組織骨保護素表達的影響

鄒新蓉 王小琴 王長江 袁軍 朱守志

（湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061）

目的：探討腎性骨?。≧OD）模型大鼠股骨組織骨保護素（OPG）表達與骨代謝的關(guān)系及中藥方腎安顆粒干預(yù)骨代謝的作用機制。方法：應(yīng)用5/6腎切除加高磷飲水建立大鼠ROD模型，隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、骨化三醇組和腎安低、高劑量組，分別給予相應(yīng)藥物灌胃8周，給藥前后檢測大鼠血清BUN、Scr、Ca、P、ALP，化學(xué)發(fā)光法測iPTH，雙能X射線測骨密度，Western blot、免疫組織化學(xué)法檢測股骨OPG表達。結(jié)果：腎安低、高劑量組大鼠血BUN、Scr與骨化三醇組、模型組比較明顯降低；腎安低、高劑量組血Ca、骨密度與模型組比較明顯升高，血P、ALP、iPTH與模型組比較明顯降低；各組大鼠骨組織OPG蛋白表達，模型組顯著低于正常對照組和假手術(shù)組，骨化三醇組和腎安低、高劑量組明顯高于模型組；腎安低、高劑量組免疫組織化學(xué)表達比模型組明顯增強。結(jié)論：ROD模型大鼠OPG表達異常與骨代謝密切相關(guān)，腎安顆?？赡芡ㄟ^上調(diào)OPG表達改善ROD骨代謝。

腎性骨病 腎安顆粒 OPG 實驗研究

腎性骨?。╮enal osteodystrophy，ROD）是由慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）引起的礦物質(zhì)代謝紊亂和內(nèi)分泌失調(diào)所導(dǎo)致的骨病[1]，是CKD患者最常見和難治的并發(fā)癥，也是終末期腎臟病患者致殘的重要原因之一。導(dǎo)致ROD的生理病理機制十分復(fù)雜，由于腎臟結(jié)構(gòu)和功能的破壞導(dǎo)致腎臟羥化酶系活性降低，1,25（OH）2VitD3的生成相對或絕對不足，甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）的合成與釋放失控，是ROD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。但腎臟、骨骼分泌的多種局部及循環(huán)激素和細胞因子，如骨形成蛋白-7、成纖維細胞生長因子、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）等也參與其中。OPG作為骨形成與骨吸收動態(tài)平衡調(diào)節(jié)的重要因子，在ROD中表達情況及與骨代謝的關(guān)系如何？本實驗觀察ROD模型大鼠鈣磷代謝、骨密度、PTH與OPG表達的關(guān)系及腎安顆粒干預(yù)后的變化，以期探討中藥復(fù)方干預(yù)ROD的可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級Wistar雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量120～150g，由湖北省實驗動物研究中心提供，合格證號：00009457。

1.2 藥物與試劑腎安顆粒（藥物組成：淫羊藿、黃芪、大黃，劑量比2∶2∶1）由湖北省中醫(yī)院制劑室制備，用蒸餾水配制成混懸液，質(zhì)量濃度分別為2.25g/mL、4.5g/mL；骨化三醇（規(guī)格：0.25μg/片）由海爾藥業(yè)提供，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為50μg/100mL的懸濁液；血iPTH免疫檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），山羊抗OPG抗體（美國Santa Cruz公司），辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗（pierce），小鼠抗大鼠β-actin（美國abcam公司），兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒配制DAB溶液（丹麥DAKO公司）。

2 實驗方法

2.1 5 /6 腎切除建立ROD大鼠模型SPF級W istar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，以3%戊巴比妥鈉（3mg/100g）腹腔注射麻醉。打開腹腔，暴露左側(cè)腎臟，剝離腎包膜，結(jié)扎左腎上下極并切除，觀察無出血后關(guān)閉腹腔。術(shù)后第2天開始給予高磷飲水（0.5g/d NaH2PO4）。1周后再次打開腹腔夾住右側(cè)腎動脈和右側(cè)輸尿管并結(jié)扎，切除右腎并關(guān)閉腹腔。

2.2 分組與給藥48只大鼠隨機分為正常對照組（8只）、假手術(shù)組（8只）、造模組（32只）。正常對照組不實施任何手術(shù)。假手術(shù)組僅打開腹腔然后關(guān)閉，不切除腎臟。造模組按上述方法行5/6腎切除術(shù)后1個月，隨機分為模型組、骨化三醇組、腎安低劑量（2.25g/mL）組、腎安高劑量（4.5g/mL）組，每組8只。腎安顆粒用蒸餾水配制成混懸液，骨化三醇用蒸餾水配制成濃度為50%的懸濁液，藥物配制后置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。術(shù)后1個月開始給予相應(yīng)藥物灌胃，大鼠灌胃容量為每日1mL/100g，正常對照組、假手術(shù)組和模型組給予等容量生理鹽水灌胃，持續(xù)8周。灌胃第3周，模型組和骨化三醇組大鼠各死亡1只。

2.3 標本采集給藥前后眼球取血，測定尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、血磷（P）、血鈣（Ca）、血清堿性磷酸酶（ALP）、血清全段甲狀旁腺激素（iPTH）。給藥結(jié)束后處死大鼠取完整雙側(cè)股骨，剝離肌肉，一側(cè)干燥后測定股骨頭部的骨密度（BMD），另一側(cè)置于4%多聚甲醛中用于Western blot和免疫組織化學(xué)標本的制備。

2.4 生化指標及iPTH測定TOSHIBA120全自動生化分析儀檢測BUN、Scr、P、Ca、ALP，IMMULITE 1000型免疫分析儀化學(xué)發(fā)光法檢測血iPTH。

2.5 骨密度測定美國雙能X線骨密度床機GE DPX-NT測定股骨頭部骨密度。

2.6 Western blot檢測提取大鼠股骨組織總蛋白，用Braford法檢測蛋白含量，PAGE凝膠電泳儀制膠，每孔上樣體積為40μL，電泳1.5h后取膠，在轉(zhuǎn)膜儀上轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)完后放入TrisNaCl中清洗10min，轉(zhuǎn)入5%脫脂奶粉中封閉1h以上，用PBST洗滌3次，每次10min，孵山羊抗OPG一抗，4℃冰箱過夜，取出后PBST洗滌3次，每次10min，孵二抗室溫1h，TBST洗滌3次，每次10min，DAB顯色，凝膠分析系統(tǒng)行密度掃描。

2.7 免疫組織化學(xué)檢查骨組織石蠟切片烘片脫蠟，用PBS沖洗3次，每次5min；以EDTA微波修復(fù)；自然冷卻后PBS洗3次，切片放入3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，PBS洗3次，甩干后5%BSA（牛血清白蛋白）封閉20min；甩去BSA液，加一抗，4℃過夜；PBS沖洗3次甩干，每張切片加50～100μL A液室溫下孵育45min；PBS洗3次甩干，每張切片加50～100μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡控制顯色；顯色完全后蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡下觀察。設(shè)不加一抗的陰性對照，以有棕黃色顆粒著色者為陽性，對每個染色后的標本順序選取20個骨視野（×200），利用圖像分析系統(tǒng)（HIPAS-1000）進行測量，染色陽性部位的深淺及范圍大小以平均吸光度表示。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠用藥前后BUN、Scr、iPTH檢測結(jié)果見表1。3.2各組大鼠用藥前后血Ca、P、ALP檢測結(jié)果見表2。

3.3 各組大鼠股骨BMD檢測結(jié)果模型組大鼠BMD明顯低于正常對照組和假手術(shù)組（P＜0.05）；骨化三醇組、腎安低劑量組、腎安高劑量組與模型組比較骨密度明顯增高（P＜0.05）；骨化三醇組、腎安低劑量組、腎安高劑量組3組間骨密度比較無明顯差異。見表3。

3.4 Western blot檢測各組大鼠股骨OPG蛋白的表達模型組大鼠股骨OPG蛋白表達明顯低于正常對照組和假手術(shù)組；骨化三醇組、腎安低劑量組、腎安高劑量組表達明顯高于模型組，其中以腎安低劑量組OPG蛋白表達增強更為明顯。見圖1。

表1 各組大鼠用藥前后BUN、Scr、iPTH測值（±s）

表1 各組大鼠用藥前后BUN、Scr、iPTH測值（±s）

注：與正常對照組用藥前比較，#P＜0.01；與本組用藥前比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組用藥后比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與骨化三醇組用藥后比較，※P＜0.05。

組別動物數(shù)（只）正常對照組8假手術(shù)組8模型組7骨化三醇組7腎安低劑量組8腎安高劑量組8 BUN（mmol/L）用藥前用藥后用藥前7.47±0.88 7.33±0.59 23.57±5.88 iPTH（pg/dL）用藥前用藥后9.28±2.05 9.74±2.36 7.86±0.80 7.09±0.83 24.14±3.29 33.71±5.91 10.82±2.94 9.28±2.05 17.04±3.77#20.2±4.57 73.57±23.07#100.14±26.71 13.08±6.65#14.04±4.50 15.90±2.62#15.75±4.33 65.83±10.74#73.50±19.68 12.12±3.92#9.62±1.51▲▲★★15.67±4.18#12.5±2.51▲★72.33±21.40#59.67±9.37▲★※12.36±2.19#8.72±1.21▲▲★★15.72±3.84#13.7±2.34▲★74.60±16.50#60.80±8.32▲★※11.95±3.47#9.30±0.73▲▲★★Scr（μmol/L）用藥后33.86±5.40

表2 各組大鼠用藥前后血Ca2+、P3+、、ALP測值（±s）

表2 各組大鼠用藥前后血Ca2+、P3+、、ALP測值（±s）

注：與正常對照組用藥前比較，#P＜0.05；與本組用藥前比較，▲P＜0.05；與模型組用藥后比較，★P＜0.05；與骨化三醇組用藥后比較，※P＜0.05。

組別動物數(shù)（只）正常對照組8假手術(shù)組8模型組7骨化三醇組7腎安低劑量組8腎安高劑量組8 Ca2+（mmol/L）用藥前用藥后用藥前2.99±0.15 2.93±0.05 2.11±0.30 ALP（IU/L）用藥前用藥后156.57±23.25 122.43±29.11 3.07±0.08 3.16±0.16 2.36±0.48 2.47±0.42 156.14±28.02 128.71±48.93 1.99±0.41#1.87±0.45 3.84±0.59#4.13±0.91 181.57±42.27 197.00±31.53 2.11±0.84#2.98±0.12▲★3.65±0.74#3.41±0.73 167.33±21.95 130.67±22.98▲★2.00±0.26#2.76±0.12▲★3.48±0.64#2.56±0.15▲★※172.00±38.29 135.17±23.37▲★2.06±0.05#2.88±0.08▲★3.70±0.65#2.74±0.26▲★※182.20±20.69 133.60±40.67▲★P3+（mmol/L）用藥后1.82±0.25

表3 各組大鼠用藥后BMD測值（±s）

表3 各組大鼠用藥后BMD測值（±s）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05。

組別動物數(shù)（只）BMD（g/cm2）正常對照組8164.75±41.60假手術(shù)組8 168.36±13.45模型組7 120.15±12.02#骨化三醇組7 160.13±4.86★腎安低劑量組8 165.73±8.22★

圖1 Western blot檢測各組大鼠股骨OPG蛋白的表達

3.5 免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠股骨OPG表達結(jié)果免疫組織化學(xué)所見棕色為OPG陽性表達。模型組大鼠股骨OPG表達與正常對照組、假手術(shù)組比較明顯減弱；骨化三醇組、腎安低劑量組、腎安高劑量組OPG表達與模型組比較明顯增強，其中以腎安低劑量組更為明顯。見圖2。

4 討論

OPG是腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族新成員，是由基質(zhì)細胞、成骨前體細胞、破骨前體細胞產(chǎn)生的一種跨膜結(jié)構(gòu)域的分泌性蛋白[2]，作為假受體通過與RANK競爭結(jié)合RANKL阻斷其作用，抑制破骨細胞的分化、成熟，誘導(dǎo)破骨細胞凋亡。OPGmRNA在人體的多種組織和細胞系廣泛表達，在肺、心臟、腎、肝、胃腸、腦、脊髓、甲狀腺和骨中表達最多，動物實驗表明以腎臟含量最多[3]。體外實驗證實，OPG抑制前體破骨細胞分化和成熟破骨細胞形成骨吸收陷窩，而1,25（OH）2D3能抑制OPG mRNA的表達及OPG蛋白的合成，促進破骨細胞前體分化成熟，使破骨細胞數(shù)量增加，促進骨吸收，維持骨代謝平衡；體內(nèi)實驗注射重組OPG可誘導(dǎo)破骨細胞凋亡[4]。

OPG在體內(nèi)的表達受多種因素調(diào)控，如1,25（OH）2D3、PTH、TGF-α、TGF-β、NO、IL-1β、Ca2+、雌激素、腎上腺素等。多種細胞因子和激素通過上調(diào)或下調(diào)RANKL/OPG間接對骨代謝發(fā)揮作用。實驗表明，PTH長時間持續(xù)刺激導(dǎo)致破骨細胞的活動加強，使骨吸收作用增加，從而骨量減少[5]。PTH作為ROD進程中的核心環(huán)節(jié)之一，刺激破骨細胞的分化作用，是通過成骨細胞的OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的PKA信號通路，提高RANKL表達和降低成骨細胞生成OPG來完成[6-7]。OPG在骨質(zhì)疏松癥、免疫性骨關(guān)節(jié)病、骨硬化癥、骨腫瘤及心血管病等臨床疾病中的研究較多，但其在CKD和ROD中的研究鮮少報道。

本研究中，各造模組大鼠給藥前BUN、Scr較正常對照組明顯升高，血鈣降低，血磷上升，PTH水平亦升高，血清ALP上升，表明隨大鼠腎功能下降，其鈣磷代謝紊亂，甲狀旁腺功能亢進，骨重塑與形成減少。蛋白印跡及免疫組化的結(jié)果顯示，各造模組大鼠股骨OPG的表達均較正常對照組和假手術(shù)組降低，給予骨化三醇和不同濃度腎安干預(yù)后能使OPG在骨組織中的表達水平升高，但以腎安2.25g/mL劑量用藥對OPG的表達升高作用更為明顯。給藥后，不同濃度腎安組的腎功能均得到改善，且隨著OPG水平的升高，骨密度的降低得到緩解，低鈣、高磷、高PTH水平也明顯改善。

中醫(yī)學(xué)理論認為，“腎藏精，精生髓，髓成骨”，“腎主骨”（《素問·宣明五氣》），“腎生骨髓”“腎充則髓實”（《素問·陰陽應(yīng)象大論》），“腎為先天之本”，腎所藏之精，所主之液皆可化生骨髓，為“腎主骨”提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。若腎精充實，則髓化有源，骨得其養(yǎng)而堅固有力、活動靈便；若腎不藏精，腎精虧虛，則“腎主骨”功能亦失職，骨髓化生乏源骨失其養(yǎng)，將會出現(xiàn)骨骼脆弱、腰背疼痛、脛酸膝軟、容易骨折等癥狀，發(fā)為“骨痿”、“虛勞”、“骨痹”。腎與骨的密切聯(lián)系體現(xiàn)在ROD的整個發(fā)病過程中，脾腎虧虛，氣血不足，又水濕、濕熱、濕濁、瘀毒等邪實為患，使得骨失所養(yǎng)、髓化乏源，而腎虛濁瘀是ROD的發(fā)病關(guān)鍵。因此，針對ROD的發(fā)病機制，補腎泄?jié)崾侵委烺OD的根本方法。

腎安顆粒組方中淫羊藿能補腎壯陽、益精健骨，已有研究表明淫羊藿總黃酮（主要成分為淫羊藿苷）可能通過增加成骨細胞OPG的表達來抑制破骨細胞的分化和成熟，從而抑制骨吸收[8]。淫羊藿還可以提高腎臟BMP-7蛋白的表達，并作用于骨組織，上調(diào)骨組織BMP-7的表達，發(fā)揮其誘導(dǎo)成骨作用，增加骨形成，對抗糖皮質(zhì)激素所引起骨損害[9]。黃芪能補益肺脾，黃芪甲苷是黃芪的代表性活性成分之一，能減輕小管間質(zhì)的損傷，抑制腎纖維化。大黃功能清濕熱化瘀祛濁排毒，抑制腎臟高代謝，抑制系膜細胞增生，改善脂質(zhì)代謝，從多方面延緩慢性腎衰竭。既往的動物實驗顯示腎安顆粒能抑制ROD模型大鼠骨組織FGF-23的表達和上調(diào)BMP-7的表達[10-11]。

本實驗證實，腎安顆粒在改善腎功能的同時能上調(diào)殘余腎模型大鼠股骨組織OPG蛋白表達，從而改善ROD模型大鼠骨代謝，推測其改善骨代謝途徑可能與上調(diào)OPG表達有關(guān)，但具體調(diào)節(jié)機制還有待進一步研究。

[1]Simon M，Maresh JG，Harris SE，et al.Expression of bonemorphogenetic protein-7 mRNA in normal and ischemic adult ratkidney.Am JPhysiol，1999，276，F(xiàn)382

[2]Min H，MoronyS，SarosiI，et al.Osteoprogerin reverses osteoporosis by inhibiting endosteal osteoclasts and prevents vascular calcification by blocking a process resembling osteoclastogenesis.J Exp Med，2000，192（4）：463

[3]BostanciN，genliT，EmingilG，et al.Gingival crevicular fluid levels of RANKL and OPG in periodontal diseases：implications of their relative ratio.J Clin Periodontol，2007，34（5）：370

[4]田慶顯，黃公怡.1,25二羥維生素D3對小鼠成骨細胞OPG和RNAKL基因表達的影響.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2004，26（4）：418

[5]Lacey DL，Tan HL，Lu J，et al.Osteoprotegerin ligand modulates murine osteoclast survival in vitro and in vivo.Am J Pathol，2000，157（2）：435

[6]Anca Gal-Moscovici，Stuart M.Sprague.Bone health in chronickidney disease-mineral and bone disease.Advances in Chronickidney Disease，2007，14：27

[7]QIAN Y，ZHU P，WANG WM，et al.Study of the PKA and PKC signal transduction pathway of regulation of OPG and RANKL mRNA expression by hPTH（1·34）.Journal of Chinese Microcirculation，2007，11（5）：293

[8]劉亦恒，臧洪敏，張海英，等.淫羊藿總黃酮對成骨細胞中OPG和RANKL mRNA基因表達影響的實驗研究.中藥材，2005，28（12）：1076

[9]周樂，吳燎，崔鐵.淫羊藿對腎陽虛雄性大鼠腎臟和股骨BMP-7表達的影響.中國骨質(zhì)疏松雜志，2008，14（2）：90

[10]鄒新蓉，王小琴，馬曉紅，等.腎安顆粒對ROD模型大鼠骨組織FGF-23表達及骨代謝的影響.臨床腎臟病雜志，2012，12（9）：418

[11]鄒新蓉，王小琴，王長江，等.腎安顆粒對腎性骨病模型大鼠骨組織BMP-7表達及骨代謝的影響.湖北中醫(yī)雜志，2013，35（4）：11

R692.05

A

1672-397X（2014）07-0071-04

鄒新蓉（1972-），女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治腎病。frank_judy@163.com

2014-03-14

編輯：吳寧

國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目（財社【2011】172號）；武漢市重點學(xué)科帶頭人項目（201051730560）；武漢市軟科學(xué)研究計劃項目（20107105038）