四逆湯對(duì)急性缺血性心肌梗死模型大鼠SOD和MDA的動(dòng)態(tài)藥效及各指標(biāo)間相關(guān)性研究

尹翠翠1 藺建軍1，2 楊勇1 容蓉1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355；2.山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東泰安 271000）

四逆湯對(duì)急性缺血性心肌梗死模型大鼠SOD和MDA的動(dòng)態(tài)藥效及各指標(biāo)間相關(guān)性研究

尹翠翠1 藺建軍1，2 楊勇1 容蓉1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355；2.山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東泰安 271000）

目的：觀察四逆湯對(duì)急性缺血性心肌梗死模型大鼠SOD和MDA的動(dòng)態(tài)藥效，分析時(shí)間與SOD和MDA指標(biāo)相關(guān)性。方法：將Wistar大鼠隨機(jī)分為心肌缺血組、假手術(shù)組、四逆湯組。心肌缺血組：于左冠狀動(dòng)脈前降支起始部下2mm處結(jié)扎；假手術(shù)組：穿線不結(jié)扎；四逆湯組：預(yù)先給大鼠灌服四逆湯4d，第4日給藥30min后，進(jìn)行急性缺血性心肌梗死手術(shù)。分別于手術(shù)后按時(shí)間點(diǎn)0、5、10、20、40、60、90、120、150、180、210、360m in腹主動(dòng)脈采血，檢測(cè)SOD和MDA含量，分析動(dòng)態(tài)藥效和時(shí)間與指標(biāo)間的相關(guān)性。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，心肌缺血組大鼠SOD（40、120、150、180、210、360min）、四逆湯組SOD（5、210、360min）含量顯著降低，心肌缺血組MDA（10、60、90、150、210min）、四逆湯組MDA（210min）含量顯著升高；在造模后40m in時(shí)，四逆湯組大鼠SOD明顯高于心肌缺血組；造模后10、60、120、150m in時(shí)，四逆湯組大鼠MDA含量明顯低于心肌缺血組。心肌缺血組、四逆湯組SOD含量與時(shí)間變化均為負(fù)相關(guān)關(guān)系，四逆湯組MDA含量與時(shí)間變化為正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：四逆湯能夠有效地清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕對(duì)缺血心肌的損傷，對(duì)大鼠缺血心肌具有一定的保護(hù)作用。但通過與時(shí)間相關(guān)性分析，提示四逆湯所具有的減輕氧自由基損傷作用可能不是其抗急性缺血性心肌梗死的主要途徑。

缺血性心肌梗死 四逆湯 SOD MDA 實(shí)驗(yàn)研究

四逆湯始載于《傷寒論》，由炮附子、干姜、炙甘草組成，具有回陽(yáng)救逆之功效，在現(xiàn)代臨床中應(yīng)用廣泛，療效較好。作為回陽(yáng)救逆的經(jīng)典醫(yī)方，四逆湯對(duì)心血管系統(tǒng)有良好的保護(hù)和治療作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，四逆湯具有明顯的抗心臟、腸、腦等器官缺血-再灌注損傷的作用，其機(jī)制可能與清除氧自由基和增加組織灌流量有關(guān)[1-3]。超氧化物歧化酶（SOD）在生物體內(nèi)具有清除自由基的首要作用；丙二醛（MDA）是一種脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，它具有的細(xì)胞毒性可引起細(xì)胞代謝及功能障礙，因此通過測(cè)定MDA的含量能反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度。這些研究表明，SOD、MDA的含量及其變化可以作為心肌梗死損傷程度的觀測(cè)指標(biāo)。本研究通過觀察急性缺血性心肌梗死模型大鼠經(jīng)四逆湯治療后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中SOD、MDA含量，以分析四逆湯通過抗自由基損傷途徑防護(hù)心肌缺血的動(dòng)態(tài)效應(yīng)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，132只，體重250～300g，由山東魯抗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（魯）20080002。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～26℃，相對(duì)濕度40%～70%RH。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；UV2201紫外分光光度計(jì)（日本島津）；JA5003型電子天平（上海精科天平廠）；GL-20A型全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)（湖南離心機(jī)廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑丙二醛（MDA）試劑盒，批號(hào)：20111216；總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒，批號(hào)：20110827，由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥材附子，產(chǎn)地四川省江油，為毛茛科多年生草本植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx的子根的加工品。甘草，產(chǎn)地河北，為豆科（Leguminosae）植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖。干姜，產(chǎn)地廣西來賓，為姜科多年生草本姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖。以上藥材均購(gòu)于山東濟(jì)南建聯(lián)藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李峰教授鑒定合格。以傳統(tǒng)臨床常用處方（黑附子30g、干姜20g、炙甘草30g）用量比例，按照本課題前期優(yōu)化的提取方法[4]，將各單味藥分別提取，合并四逆湯提取液，藥物濃度為2g生藥材/mL，4℃冷藏備用。

1.5 動(dòng)物分組與模型制備Wistar大鼠共132只，隨機(jī)分假手術(shù)組36只、心肌缺血組36只和四逆湯組60只。心肌缺血模型制備：用4%水合氯醛腹腔麻醉后，氣管插管，行人工呼吸；左側(cè)第3、4肋間開胸，剪開心包，暴露心肌，并用圓形無創(chuàng)縫合針6/0絲線置于左冠狀動(dòng)脈前降支起始部下2mm處備用；結(jié)扎左冠狀前降支動(dòng)脈，以ECGⅡ?qū)?lián)ST段明顯抬高或T波高聳、心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功的標(biāo)志。心肌缺血組和四逆湯組大鼠按此方法造模，假手術(shù)組大鼠穿線不結(jié)扎。四逆湯組大鼠造模前預(yù)先給四逆湯灌胃4d，大鼠給藥劑量為21.60g生藥材/kg體重，第4日給藥30m in后進(jìn)行造模。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)各組大鼠造模成功后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，按時(shí)間點(diǎn)0、5、10、20、40、60、90、120、150、180、210、360m in（心肌缺血組、假手術(shù)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只大鼠，四逆湯組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠），分別腹主動(dòng)脈采血，肝素抗凝，置冷凍離心機(jī)中，3000r/m in離心10min，取上清，-20℃保存待用。按試劑盒說明采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)SOD、MDA含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用單因素方差（LSD檢驗(yàn)）進(jìn)行組間差異分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson相關(guān)性分析進(jìn)行各指標(biāo)時(shí)間點(diǎn)間的差異性分析，以P＜0.05為差異呈顯著性線性相關(guān)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中SOD含量與假手術(shù)組比較，心肌缺血組大鼠在40、120、180、210、360min時(shí)間點(diǎn)，四逆湯組在5、210、360min時(shí)間點(diǎn)，血漿中SOD含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與心肌缺血組比較，四逆湯組大鼠在40min時(shí)間點(diǎn)血漿SOD含量明顯升高（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中SOD含量比較±s）U/mL

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中SOD含量比較±s）U/mL

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與心肌缺血組比較，△P＜0.05

圖1 各組大鼠不同時(shí)段SOD含量變化

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中MDA含量與假手術(shù)組比較，心肌缺血組大鼠在10、60、120、150、210min時(shí)間點(diǎn)，四逆湯組在210min時(shí)間點(diǎn)，血漿MDA的含量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與心肌缺血組比較，四逆湯組大鼠在10、60、120、150min時(shí)間點(diǎn)血漿MDA含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表2、圖2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中MDA含量比較（±s）nmol/mL

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中MDA含量比較（±s）nmol/mL

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與心肌缺血組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

圖2 各組大鼠不同時(shí)段MDA含量變化

2.3 各組時(shí)間與SOD、MDA含量間的相關(guān)性分析

2.3.1 假手術(shù)組時(shí)間與SOD、MDA含量間的相關(guān)性分析時(shí)間與SOD、MDA含量間的指數(shù)相關(guān)系數(shù)分別為-0.415、0.363（P＞0.05），尚不認(rèn)為它們之間有線性相關(guān)關(guān)系，見圖3。

圖3 假手術(shù)組時(shí)間與SOD、MDA含量間的相關(guān)性分析

2.3.2 心肌缺血組時(shí)間與SOD、MDA含量間的相關(guān)性分析

時(shí)間與SOD含量的指數(shù)相關(guān)系數(shù)為-0.686（P＜0.05），為負(fù)相關(guān)關(guān)系；時(shí)間與MDA含量的指數(shù)相關(guān)系數(shù)為0.156（P＞0.05），尚不認(rèn)為它們之間有線性相關(guān)關(guān)系。見圖4。

圖4 心肌缺血組時(shí)間與SOD、MDA含量間的相關(guān)性分析

2.3.3四逆湯組時(shí)間與SOD、MDA含量間的相關(guān)性分析時(shí)間與MDA含量的指數(shù)相關(guān)系數(shù)為0.791（P＜0.05），為正相關(guān)關(guān)系；時(shí)間與SOD含量的指數(shù)相關(guān)系數(shù)為-0.804（P＜0.01），為負(fù)相關(guān)關(guān)系。見圖5。

圖5 四逆湯組時(shí)間與SOD、MDA間的相關(guān)性分析

3 討論

本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組SOD含量與時(shí)間尚無相關(guān)性關(guān)系，心肌缺血組、四逆湯組SOD含量與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。假手術(shù)組、心肌缺血組MDA含量與時(shí)間尚無相關(guān)性關(guān)系，四逆湯組MDA含量與時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。提示雖然四逆湯提取物能清除氧自由基，減輕缺血心肌的損傷，對(duì)大鼠心梗模型具有一定的保護(hù)作用，但隨著時(shí)間的增加，四逆湯抗大鼠急性心肌缺血的作用，與其增加機(jī)體SOD的含量，降低MDA含量的變化不是十分密切。通過相關(guān)性數(shù)據(jù)分析，提示四逆湯減輕氧自由基損傷不是其抗急性缺血性心肌梗死的主要途徑，有可能通過其他機(jī)制起作用，有待進(jìn)一步研究。

[1]孫慧蘭，吳偉康，羅漢川，等.四逆湯有效部位抗心肌缺血-再灌注損傷作用.中草藥，2006，37（1）：77

[2]劉克玄，吳偉康，羅漢川，等.四逆湯對(duì)大鼠腸缺血再灌注后腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響.中國(guó)病理生理雜志，2004，20（4）：636

[3]顏建云，吳偉康，陸立鶴，等.四逆湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血后bax、bcl-2表達(dá)的影響.中國(guó)病理生理雜志，2005，21（4）：669

[4]王曉莉，鞏麗麗，容蓉，等.3種方法制備的四逆湯中甘草苷、甘草酸含量測(cè)定.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（6）：71

R542.220.5

A

1672-397X（2014）02-0075-03

尹翠翠（1987-），女，碩士研究生。研究方向：經(jīng)方的現(xiàn)代研究。

楊勇，yy7204@yahoo.com.cn

2013-07-20

編輯：吳寧

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（Z09LF31）