四二杞烏顆粒對(duì)卵巢早衰模型大鼠血清抗苗勒管激素的影響

孫夕平劉冬巖

（1 山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，山西 太原 030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，山西 太原 030010）

四二杞烏顆粒對(duì)卵巢早衰模型大鼠血清抗苗勒管激素的影響

孫夕平1劉冬巖2

（1 山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，山西 太原 030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，山西 太原 030010）

目的研究四二杞烏顆粒對(duì)雷公藤多甙片（TWP）所致的卵巢早衰（POF）模型大鼠血清抗苗勒管激素（AMH）及性激素的水平變化，探討抗苗勒管激素（AMH）在早期預(yù)測(cè)和診斷POF中的價(jià)值。方法40只12周齡健康雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為造模組（30只）空白對(duì)照組（10只）。造模組成功建立TWP所致的大鼠POF模型后，將模型組隨機(jī)分為四二杞烏顆粒實(shí)驗(yàn)組、己烯雌酚對(duì)照組、空白對(duì)照組（每組10只），再分別給予四二杞烏顆粒混懸液、己烯雌酚混懸液、等體積的生理鹽水（模型對(duì)照組和空白對(duì)照組）連續(xù)灌胃14 d。檢測(cè)大鼠血清抗苗勒管激素、促卵泡激素、黃體生成素、雌二醇水平，觀察大鼠卵巢組織形態(tài)和動(dòng)情周期變化。結(jié)果雷公藤多甙片所致的卵巢早衰大鼠血清AMH、E2水平較空白對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)SH、LH水平較空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）；四二杞烏顆粒治療后，可使大鼠血清AMH、E2、FSH、LH水平接近空白對(duì)照組水平，并改善大鼠卵巢組織形態(tài)和動(dòng)情周期。結(jié)論四二杞烏顆粒治療卵巢早衰大鼠效果好，AMH可作為卵巢早衰早期預(yù)測(cè)和診斷指標(biāo)之一。

卵巢早衰；四二杞烏顆粒；雷公藤多甙片造模；抗苗勒管激素

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指月經(jīng)初潮正常或青春期延遲，第二性征發(fā)育正常的女性在40歲前發(fā)生卵巢功能衰竭，表現(xiàn)為繼發(fā)性閉經(jīng)、雌激素水平下降和促性腺激素水平上升。目前趨同的卵巢早衰診斷標(biāo)準(zhǔn)為閉經(jīng)3～6個(gè)月，且至少有2次以上促卵泡激素＞40 mIU/mL及低雌激素水平[1]。卵巢早衰危害婦女健康，導(dǎo)致一系列生殖內(nèi)分泌及健康問題，使患者喪失生殖能力、生殖器萎縮，長(zhǎng)期低雌激素增加了骨質(zhì)丟失和心血管疾病等風(fēng)險(xiǎn)。目前POF確切的病因尚不清楚，諸多觀點(diǎn)仍處于研究階段[2]。如何防治卵巢早衰，改善卵巢早衰患者生活質(zhì)量，是目前國(guó)內(nèi)外亟待解決的重要問題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，未交配健康Wistar大鼠40只，12周齡，體質(zhì)量180～220 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后備用。

雷公藤多甙片（上海復(fù)旦浮華藥業(yè)有限公司，規(guī)格10毫克/片，生產(chǎn)批號(hào)：120805）；四二杞烏顆粒（方藥組成：當(dāng)歸、熟地、川芎、白芍、女貞子、墨旱蓮、何首烏、枸杞子，由山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中藥制劑室制成）；己烯雌酚片（合肥久聯(lián)制藥有限公司，規(guī)格1.5毫克/片，生產(chǎn)批號(hào)：20100920），抗苗勒管激素試劑盒（上海史瑞可生物科技有限公司）。促卵泡激素試劑盒、黃體生成素試劑盒、雌二醇激素試劑盒（北京華陰生物技術(shù)研究所）。

1.2 模型建立及分組

40只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（n=10）和造模組（n=30），將模型組大鼠用雷公藤多甙片懸浮液50 mg/（kg·d）灌胃，連用14 d，空白對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃。每日早上9時(shí)進(jìn)行陰道涂片，觀察動(dòng)情周期，大鼠動(dòng)情周期紊亂，表示大鼠卵巢早衰造模成功。造模成功后，造模組隨機(jī)分為四二杞烏顆粒實(shí)驗(yàn)組、己烯雌酚對(duì)照組、模型對(duì)照組，每天分別給與2.5 mL四二杞烏顆粒混懸液（含藥量2.64 g/mL）、0.08 mg/kg己烯雌酚混懸液、等體積生理鹽水灌胃，空白對(duì)照組等體積生理鹽水灌胃，連用14 d。給藥結(jié)束后24 h，4組大鼠給予10%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈采血，處死，留取卵巢。

1.3 標(biāo)本處理與檢測(cè)

普通光鏡下通過陰道涂片觀察大鼠動(dòng)情周期變化。末次給藥后24 h采用腹腔注射10%的水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈采血4 mL，離心后取上清液，放置于零下20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。最后頸椎脫臼法處死大鼠，剖腹摘取卵巢子宮，去除周圍游離脂肪組織，10%的甲醛溶液固定，做病理切片，電鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)改變。用促卵泡激素試劑盒、黃體生成素試劑盒、雌二醇試劑盒放免法檢測(cè)大鼠血清FSH、LH、E2含量。用抗苗勒管激素試劑盒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清AMH含量。

表1 抗苗勒管激素及性激素含量的檢測(cè)

圖1 空白對(duì)照組×40

圖2 模型對(duì)照組×40

圖3 四二杞烏顆粒實(shí)驗(yàn)組×40

圖4 己烯雌酚對(duì)照組×40

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)均采取雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 陰道涂片檢查結(jié)果：造模前，每只大鼠的動(dòng)情周期均為4～5天/次，動(dòng)情間期、動(dòng)情前期、動(dòng)情期和動(dòng)情后期依次交替出現(xiàn)；雷公藤多甙片灌胃后，造模組大鼠動(dòng)情周期紊亂，動(dòng)情周期延長(zhǎng)6～9 d或持續(xù)的動(dòng)情周期；后期灌藥后，己烯雌酚對(duì)照組和四物杞烏顆粒實(shí)驗(yàn)組大鼠動(dòng)情周為4～6天/次，各期基本交替出現(xiàn)。

2.2 抗苗勒管激素及性激素含量的檢測(cè)，見表1。

與空白對(duì)照組比較，卵巢早衰模型對(duì)照組大鼠血清FSH、LH水平明顯升高（P＜0.05），AMH、E2水平明顯下降（P＜0.05），差異有顯著性；與模型對(duì)照組比較，四二杞烏顆粒實(shí)驗(yàn)組和己烯雌酚對(duì)照組大鼠血清FSH、LH水平明顯降低（P＜0.05），AMH、E2水平明顯升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與己烯雌酚對(duì)照組比較，四二杞烏顆粒實(shí)驗(yàn)組大鼠血清AMH、FSH、LH、E2水平變化不顯著，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 卵巢組織形態(tài)學(xué)光鏡檢測(cè)結(jié)果

空白對(duì)照組（圖1）卵巢體積大，卵泡生長(zhǎng)活躍，可見初級(jí)卵泡，生長(zhǎng)卵泡與成熟卵泡各級(jí)卵泡，黃體發(fā)育好；模型對(duì)照組（圖2）卵巢體積小，卵泡明顯減少，甚至沒有成熟卵泡，閉鎖卵泡增多，黃體減少；四二杞烏顆粒實(shí)驗(yàn)組和己烯雌酚對(duì)照組大鼠卵巢體積接近空白對(duì)照組，各級(jí)卵泡生長(zhǎng)良好，閉鎖卵泡少。

3 討 論

中藥雷公藤具有抗炎、免疫抑制和抗腫瘤等作用。雷公藤多甙是從雷公藤跟木質(zhì)部中提取的物質(zhì)，臨床上主要用于治療類風(fēng)濕疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病。雷公藤多甙片是最早研制成功的、迄今應(yīng)用最廣泛的雷公藤制劑[3]。近年來，隨著對(duì)雷公藤藥理作用的深入認(rèn)識(shí)，其對(duì)女性生殖系統(tǒng)的不良反應(yīng)已經(jīng)影響到它的廣泛應(yīng)用。有研究表明，在雷公藤制劑的臨床應(yīng)用過程中可誘發(fā)藥物性閉經(jīng)，使服藥者血清FSH、LH含量達(dá)到正常人群絕經(jīng)期水平，造成高促性腺激素水平的閉經(jīng)，抑制卵巢E2的分泌[4]。雷公藤多甙片作為一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，其對(duì)卵巢毒性作用機(jī)制可能與其損傷卵巢細(xì)胞DNA有關(guān)，若DNA損傷嚴(yán)重和（或）DNA損傷不能及時(shí)修復(fù)，側(cè)可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[5]。而卵巢細(xì)胞凋亡引起的卵泡閉鎖加劇是卵巢儲(chǔ)備功能降低和卵巢功能早衰的發(fā)病機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)選用雷公藤多甙片作為卵巢早衰造模用藥，考慮其方法簡(jiǎn)便，周期短，成功率高，重復(fù)性好，經(jīng)濟(jì)易行，并且大鼠卵巢受損害的病理結(jié)果與人類有一致之處。

AMH為二聚體糖蛋白，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族成員之一，僅表達(dá)于性腺，主要由妊娠36周至絕經(jīng)期的卵巢顆粒細(xì)胞分泌（主要為早期生長(zhǎng)卵泡、竇前卵泡和小竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞），是目前外周血能檢測(cè)到最早產(chǎn)生的物質(zhì)[6]。有研究表明卵巢早衰患者卵巢中竇前卵泡的AMH表達(dá)是正常的，而在早竇狀卵泡中的表達(dá)下降，隨著原始卵泡的耗竭，進(jìn)入生長(zhǎng)卵泡期的卵泡數(shù)減少，導(dǎo)致分泌入血清中的AMH降低，指明卵巢早衰患者血清AMH水平可用于評(píng)估婦女的卵巢儲(chǔ)備以及剩余卵泡數(shù)，AMH可以作為早期評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備降低的理想指標(biāo)[7]。卵巢儲(chǔ)備功能是指卵巢內(nèi)存留卵泡的數(shù)量和質(zhì)量，反應(yīng)女性生育能力。卵巢早衰和卵巢儲(chǔ)備功能降低互為因果關(guān)系，當(dāng)卵巢儲(chǔ)備功能下降后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和下降水平的增高，會(huì)發(fā)展到卵巢早衰[8-9]。加強(qiáng)監(jiān)測(cè)評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)卵巢早衰傾向具有重要臨床意義，AMH可調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、反映卵巢儲(chǔ)備功能，對(duì)卵巢早衰的預(yù)測(cè)和診斷有一定的應(yīng)用價(jià)值[10]。

本實(shí)驗(yàn)是在從肝論治卵巢早衰的基礎(chǔ)上的深入研究。四二杞烏顆粒是導(dǎo)師劉冬巖教授根據(jù)長(zhǎng)期的臨床經(jīng)驗(yàn)和祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論總結(jié)而成。主方由熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎、旱蓮草、女貞子、枸杞子、何首烏八味藥組成，具有養(yǎng)肝和血，滋補(bǔ)肝腎的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明四二杞烏顆粒可降低FSH、LH水平，升高AMH、E2水平，改善卵巢早衰大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)和動(dòng)情周期，改善和恢復(fù)卵巢功能。另外，雷公藤多甙片所致的卵巢早衰大鼠血清AMH、E2水平明顯降低，F(xiàn)SH、LH水平明顯升高，四二杞烏顆粒治療后，大鼠血清AMH、E2、FSH、LH水平接近正常組水平。這表明，AMH與E2、FSH、LH一起可作為評(píng)價(jià)卵巢功能的血清學(xué)指標(biāo)。在人類衰老的過程中，血清AMH的降低比FSH的升高能更早的反映卵巢早衰的衰竭。AMH有助于臨床卵巢早衰的早期預(yù)測(cè)和診斷。

[1] Goswami D,Conway GS.Premature ovarian failure[J].Hormone Research,2007,68:196.

[2] Kim JW,Choi M, Won HJ;et a1.Genetic analysis of SOHLH1 gene in premature ovarian failure[J].Fertil Steril,2010,4(Suppl 1):S183-S184.

[3] 郝娟,王春蓮,王培嵩,等.雷公藤多甙片致卵巢早衰大鼠動(dòng)物模型的研究[J].中國(guó)婦幼保健,2012,27(12):1866-1869.

[4] 高慧,楊涓,韓冰,等.藥物型卵巢早衰動(dòng)物模型的研究[J].國(guó)醫(yī)論壇,2007,22(3):22.

[5] 阮寧,施毅.雷公藤多甙的毒副作用分析[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2007, 14(26):3687.

[6] 趙志義,陳子江.抗苗勒管激素與女性生殖功能[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2009,44(7):548-550.

[7] 徐琳,任莉,韓雪松,等.AMH、FSH、E2在卵巢早衰診斷中的價(jià)值[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2011,19(3):98.

[8] Tran ND,Cedars MI,Rosen MP.The Role of Anti-Mullerian Hormone (AMH) in Assessing Ovarian Reserve[ J].J Clin Endocrinol Metab,2011,96(12):3609–3614.

[9] Masein N,Mlufi G,Bachelor A,et a1.Evaluation of different markers of the ovarian reserve in patients presenting with premature ovarian failure[J].Md Cell Endocfinol,2008,282(1-2):95-100.

[10] 秦興玲,葉元,石青峰,等.血清抗苗勒管激素預(yù)測(cè)卵巢早衰的臨床價(jià)值[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,19(25):3241.

Effect of Sierqiwu Particles on the Premature Ovarian of the Rats Serum AMH

SUN Xi-ping1, LIU Dong-yan2
(1 Graduate School of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2 The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030010, China)

ObjectiveTo study the changes of serum the anti-Müllerian hormone (AMH) and sex hormones of Sierqiwu particles on premature ovarian failure (POF) rats induced by Tripterygium wilfordii polyglycoside (TWP), and explore the value of the AMH in the early prediction and diagnosis of premature ovarian failure.Methods40 12-week-old female Wistar rats were randomly divided into model group (n=30) and blank control group (n=10), the first three groups to build modules.After establishing successfully rat model of premature ovarian failure with TWP in model group,then they were randomly divided into Sierqiwu particles experimental group, diethylstilbestrol control group, model control group ,and then they were respectively given Sierqiwu particle suspension, diethylstilbestrol suspension, same dose saline (control group and blank model control groups) for 2 weeks. Serum anti-Müllerian hormone(AMH), follicle-stimulating hormone(FSH), luteinizing hormone(LH), estradiol (E2) rat ovarian tissue morphology and estrous cyclewere obtained.ResultThe level of serum AMH ,E2were significantly lower,and FSH, LH significantly increased in premature ovarian failure compared with bank group control; but with the treatment of Sierqiwu particles, serum AMH, E2, FSH, LH levels closed to bank group control (normal levels), and meanwhile improved rat ovarian tissue morphology and estrous cycle.ConclusionEffect of Sierqiwu Particles on the Premature Ovarian in the Rats is actively and AMH can be used as one of the predictors of premature ovarian failure.

POF;Sierqiwu particles; TWP modeling; AMH

R711.75

B

1671-8194（2014）13-0043-03