常規(guī)放射檢查對(duì)人類(lèi)精子影響的初步研究

盛慧強(qiáng)趙佳駿洪 艷*

（1．浙江省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，浙江杭州 310012；2．浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州 310013）

常規(guī)放射檢查對(duì)人類(lèi)精子影響的初步研究

盛慧強(qiáng)1趙佳駿2洪 艷2*

（1．浙江省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，浙江杭州 310012；2．浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州 310013）

目的初步探討男性受到低劑量電離輻射后的生殖安全性。方法將21份新鮮精液標(biāo)本每份精液分成3組（對(duì)照組、1mGy組、50mGy組），1mGy組、50mGy組的精液樣本分別接受1mGy（相當(dāng)于普通X線片的劑量）和50mGy（相當(dāng)于CT檢查的劑量）的X線照射。照射后分別對(duì)3組精液樣本的精子活力、精子存活率、精子運(yùn)動(dòng)特征及精子DNA完整性等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和比較。結(jié)果各組間精子活力、精子存活率、精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)、精子DNA完整性經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)比較不同組別指標(biāo)間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論常規(guī)放射學(xué)檢查對(duì)男性成熟的精子是相對(duì)安全的，但對(duì)男性生精功能、精子的受精功能以及子代的安全性還需進(jìn)一步深入研究。

電離輻射；精子；DNA損傷

隨著不孕不育癥發(fā)病率的增長(zhǎng)，電離輻射對(duì)人類(lèi)生殖功能的影響也成為近年研究熱點(diǎn)之一。大多數(shù)的研究結(jié)果顯示，電離輻射會(huì)導(dǎo)致男性生殖系統(tǒng)的損傷，主要表現(xiàn)在睪丸組織結(jié)構(gòu)與功能、精子濃度、精子活力、精子形態(tài)、精子運(yùn)動(dòng)特征、精子染色體畸變以及DNA損傷等多個(gè)方面［1－5］。然而，這些結(jié)果大多基于對(duì)放療患者或是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大劑量電離輻射研究，對(duì)于低劑量電離輻射（LDR）對(duì)人體的生物學(xué)效應(yīng)仍不明確，尚未發(fā)現(xiàn)LDR對(duì)人類(lèi)精子影響的報(bào)道。本研究通過(guò)觀察常規(guī)放射檢查劑量對(duì)人類(lèi)新鮮精液的精子活力、精子存活率、精子運(yùn)動(dòng)特征及精子DNA完整性等指標(biāo)的影響，初步探討男性受到低劑量X射線照射后的生殖安全性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇2013年1～12月至浙江省人類(lèi)精子庫(kù)進(jìn)行首次精液篩查的供精志愿者，共21例，年齡22～25歲，平均（23.8±1.6）歲，全部為在校學(xué)生，未婚。所有研究對(duì)象外生殖器檢查均無(wú)異常，雙側(cè)睪丸體積均≥12mL，均簽署知情同意書(shū)，愿意將其標(biāo)本用于本次研究。

1.2 采集與分組 所有研究對(duì)象均通過(guò)手淫法采集精液于一次性無(wú)菌容器內(nèi)，置37℃恒溫培養(yǎng)箱液化。液化完全后將每份標(biāo)本分裝成3份，接受不同劑量的X線照射，其中2份樣本分別接受1mGy和50mGy的X線照射，另1份樣本不接受照射，作為陰性對(duì)照。

1.3 方法 目前常用的醫(yī)療X線檢查大致可分為普通X線平片和CT檢查，檢查時(shí)的照射劑量隨檢查部位與受檢者不同波動(dòng)較大。除了對(duì)睪丸部位的直接照射外，對(duì)其他部位進(jìn)行X線檢查時(shí)，睪丸精子接受的是散射線輻射，其劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)際照射劑量。在研究中使用接受該檢查可能受到的劑量高值，分別以1mGy和50mGy代表普通X線平片和CT的照射劑量。使用500mA醫(yī)用X線機(jī)在放射劑量?jī)x監(jiān)測(cè)下進(jìn)行多點(diǎn)曝光試驗(yàn)，分別在照射距離1m、管電壓100kV、管電流100mA、曝光時(shí)間0.2秒以及照射距離0.5m、管電壓100kV、管電流300mA、曝光時(shí)間0.8秒的條件下獲得1mGy和50mGy的照射劑量。

1.4 精液的檢查 根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版介紹的方法，在相差顯微鏡下檢測(cè)精子活力；使用伊紅－苯胺黑染色法檢測(cè)精子存活率；使用美國(guó)Hamilton公司生產(chǎn)的計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀（CASA）進(jìn)行精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)分析；精子DNA完整性檢測(cè)使用基于吖啶橙染色的精子核完整性染色試劑盒，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以（ˉx±s）表示，采用t檢驗(yàn)。利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 精子活力和存活率 經(jīng)照射處理后對(duì)精子的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程隨機(jī)選擇3管樣本的檢測(cè)順序，以排除檢查時(shí)間對(duì)精子指標(biāo)的影響。各組間的精子活力與存活率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

2.2 精子運(yùn)動(dòng)特征 表示精子運(yùn)動(dòng)特征的參數(shù)有：VAP（平均路徑速率）、VCL（曲線速率）、VSL（直線速率）、ALH（精子頭側(cè)擺幅度）、LIN（直線性）、STR（前向性）、BCF（鞭打頻率）等，本研究中三組精子運(yùn)動(dòng)特征兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1不同照射劑量下精子活力和存活率的比較

表2 不同照射劑量下精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)的比較（±s）

表2 不同照射劑量下精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)的比較（±s）

組 別nVAP（μm／s）VCL（μm／s）VSL（μm／s）ALH（μm）LIN（%）STR（%）BCF（Hz）對(duì)照組2146.01±9.1966.80±13.5136.71±8.033.52±1.0456.81±4.9779.81±3.8319.12±3.00 1mGy組2147.33±7.5468.18±11.8137.73±6.673.48±0.5556.71±5.7179.33±5.4718.61±2.49 50mGy組2146.31±8.0367.31±12.9737.21±7.013.37±0.6056.91±5.6679.52±4.9519.34±2.69

2.3 精子DNA完整性 精子的DNA完整性主要參數(shù)有DNA碎片指數(shù)（DFI）和精子高DNA可染性（HDS），基于流式細(xì)胞術(shù)的精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）被認(rèn)為是檢測(cè)精子DNA完整性的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，使用SCSA檢測(cè)的三組精致DNA完整性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 不同照射劑量下精子DNA 完整性的比較

3 討 論

聯(lián)合國(guó)原子輻射效應(yīng)科學(xué)委員會(huì)（UNSCEAR）指出LDR是指劑量在0.2Gy以?xún)?nèi)的低線性能量傳輸（LET）輻射或劑量在0.05Gy以?xún)?nèi)、劑量率在0.05mGy／min以?xún)?nèi)的輻射。在醫(yī)療照射中，除了用于治療腫瘤的放射療法以外，一般出于診斷目的的放射學(xué)檢查（如透視、平片、CT等）劑量均屬于LDR的范疇。然而前期大部分的研究都聚焦于大劑量電離輻射對(duì)人體的影響，LDR對(duì)人體的影響目前仍無(wú)定論。深入研究LDR對(duì)人類(lèi)的生物學(xué)效應(yīng)對(duì)于現(xiàn)行的輻射防護(hù)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)是否合理、有無(wú)必要增加或減少輻射防護(hù)條件、如何正確對(duì)待日常生活中所受到的電離輻射等一系列問(wèn)題都至關(guān)重要。在人類(lèi)的生殖領(lǐng)域，LDR生物學(xué)效應(yīng)的研究顯得尤為重要。

在大劑量電離輻射對(duì)精子的影響研究中，睪丸組織結(jié)構(gòu)與功能、精子濃度、精子活力、精子形態(tài)、精子運(yùn)動(dòng)特征、精子染色體以及DNA等發(fā)生改變已有報(bào)道［1－5］，在低劑量條件下是否同樣存在這些指標(biāo)的改變?nèi)杂写诟嘌芯?。本研究?duì)象為人類(lèi)離體的新鮮精液標(biāo)本，一般情況下可以代表已經(jīng)分化發(fā)育成熟的精子，所以在活體照射下可能發(fā)生的睪丸組織損傷、精子濃度以及形態(tài)的改變，在離體標(biāo)本中不能觀察到，因此，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道以及輻射損傷的機(jī)制，作者遴選了精子活力、精子存活率、精子運(yùn)動(dòng)特征以及精子DNA完整性作為本研究觀察的指標(biāo)。

精子活力是描述精子運(yùn)動(dòng)能力的參數(shù)，尤其是前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）是精液質(zhì)量很重要的指標(biāo)，與臨床妊娠率相關(guān)［6］；通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精子分析（CASA）得到的精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)也是描述精子運(yùn)動(dòng)能力的一個(gè)指標(biāo)，其結(jié)果具有高度的精確性并能提供精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)的量化數(shù)據(jù)，與體內(nèi)、體外受精率及受孕所需時(shí)間顯著相關(guān)［7］。精子的運(yùn)動(dòng)受多種因素影響，精子尾部結(jié)構(gòu)異常、精液的黏稠度、pH值、滲透壓、溫度、精漿中的無(wú)機(jī)離子、病原微生物、細(xì)胞因子、抗精子抗體、與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白酶以及其他理化因素都可能影響精子的運(yùn)動(dòng)能力。電離輻射產(chǎn)生的自由基可通過(guò)對(duì)精子細(xì)胞膜過(guò)氧化損害及改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性使精子活動(dòng)能力喪失，也可使精子線粒體內(nèi)外膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜的脂層排列松散，內(nèi)膜嵴減少，ATP合成減少，進(jìn)而影響精子的運(yùn)動(dòng)能力［8］。本研究結(jié)果顯示，在1mGy和50mGy的X線照射下，精子的活力與對(duì)照組相比均沒(méi)有發(fā)生明顯的下降，各組的運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)也沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，這可能是照射的劑量尚不足以引起上述機(jī)制所致的改變。有研究顯示，小鼠在接受0.5 Gy以上劑量的電離輻射后，與精子活力相關(guān)的蛋白如熱休克蛋白－2（HSP70－2），磷脂酶C（PLC），谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GPX4），β－微蛋白（β－tubulin）及甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDHS）等差異表達(dá)［9］。在離體標(biāo)本中可能觀察不到這種現(xiàn)象，因?yàn)楦骷?jí)生精細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的程度不盡相同，到晚期精子細(xì)胞階段已幾乎沒(méi)有蛋白質(zhì)合成。

精子存活率是指活精子占所有精子數(shù)的比例，可以通過(guò)伊紅－苯胺黑染色法或低滲膨脹試驗(yàn)檢測(cè)精子膜的完整性來(lái)評(píng)價(jià)，本研究使用伊紅－苯胺黑染色法，具有背景清晰、易于辨別及玻片長(zhǎng)期保存的優(yōu)點(diǎn)。電離輻射可以直接損傷精子細(xì)胞導(dǎo)致精子死亡，也可誘導(dǎo)生精細(xì)胞的凋亡［10］，這些死亡的精子的膜完整性將受到破壞，從而改變精子存活率檢測(cè)的結(jié)果。本研究結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)劑量的X線照射對(duì)離體成熟精子的膜完整性沒(méi)有顯著影響。

精子DNA是遺傳信息的載體，其完整性對(duì)種族的繁衍具有重要意義，如果男性精液含有高百分比的精子DNA碎片，意味著自然繁殖潛力低下［11］。有研究表明在輔助生殖技術(shù)中，精子DNA的損傷程度與臨床妊娠率呈負(fù)相關(guān)［12－13］，并且與妊娠后的自然流產(chǎn)有關(guān)［14］，還可以影響受精卵的分裂以及胚胎的發(fā)育［15］；有學(xué)者在一項(xiàng)基于動(dòng)物性實(shí)驗(yàn)的研究中，認(rèn)為DNA損傷可能對(duì)子代產(chǎn)生長(zhǎng)期影響，如異常增長(zhǎng)、過(guò)早衰老、異常行為、間質(zhì)腫瘤等［16］。精子DNA的損傷與多種因素相關(guān)，如老齡化、吸煙、空氣污染、禁欲時(shí)間延長(zhǎng)、睪丸異常變暖及其他多種理化因素等［17］。電離輻射引起主要生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)靶目標(biāo)為DNA，能夠引起各種DNA損傷，包括DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA－DNA交聯(lián)、堿基損傷和單鏈斷裂與雙鏈斷裂等［18］，其中核DNA雙鏈斷裂被認(rèn)為是電離輻射引起細(xì)胞程序性死亡的最主要原因，由此可見(jiàn)在評(píng)估電離輻射對(duì)生殖健康的影響中，精子DNA完整性的檢測(cè)具有非常重要的意義?；诹魇郊?xì)胞術(shù)的精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）被認(rèn)為是檢測(cè)精子DNA完整性的金標(biāo)準(zhǔn)，可以得出DNA碎片指數(shù)（DFI）和精子高DNA可染性（HDS）兩個(gè)指標(biāo)，本研究中，各組精子的DFI與HDS兩指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，在不超過(guò)50mGy的低劑量X線照射條件下未發(fā)生損傷效應(yīng)，可以認(rèn)為常規(guī)的放射學(xué)檢查（X線平片、CT等）對(duì)男性離體成熟的精子是相對(duì)安全的。對(duì)這個(gè)“安全”的理解可以分為兩個(gè)方面：一方面是僅僅針對(duì)成熟精子而言，從生精細(xì)胞的發(fā)育、增殖、減數(shù)分裂、變態(tài)到成熟包含了很多復(fù)雜的生理過(guò)程，每個(gè)過(guò)程都有其獨(dú)有的特點(diǎn)和復(fù)雜性，而且各個(gè)階段對(duì)電離輻射的敏感性不同，不能一概而論；另一方面是相對(duì)的安全，受限于研究對(duì)象和研究條件，作者只研究了低劑量X射線對(duì)人類(lèi)新鮮精液的精子活力、精子存活率、精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)以及精子DNA完整性的影響，尚未涉及睪丸的生精功能、精子的受精功能及子代的出生缺陷以及癌癥風(fēng)險(xiǎn)等方面。所以，要想評(píng)估LDR對(duì)人類(lèi)的生殖安全性，仍需進(jìn)行大量系統(tǒng)深入的研究。

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*為通訊作者，Email：hongy1008＠163.com