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    膀胱癌間質(zhì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜及轉(zhuǎn)移潛能評價(jià)分析

    2014-04-15 15:04:43,,,
    精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志 2014年5期
    關(guān)鍵詞:浸潤性膀胱癌生物學(xué)

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    (青島大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科,山東 青島 266071)

    在世界范圍內(nèi),膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第9位[1]。在我國,男性膀胱癌發(fā)病率居全身腫瘤的第8位,女性為第12位[2]。膀胱癌中移行細(xì)胞癌最多見,其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高,受到廣泛關(guān)注[3]。轉(zhuǎn)移是決定浸潤性膀胱癌的侵襲性及臨床預(yù)后最重要的臨床病理特征,30%的浸潤性膀胱癌病人確診時(shí)鏡下已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移,超過90%的病人最終死于腫瘤轉(zhuǎn)移。膀胱腫瘤又為異質(zhì)性腫瘤,TNM系統(tǒng)不能完全評價(jià)腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能。腫瘤間質(zhì)是腫瘤不可或缺的組成部分,其對腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能的調(diào)控機(jī)制一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。本研究以膀胱腫

    瘤間質(zhì)蛋白作為研究對象,以放射性核素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)(iTRAQ法)獲取腫瘤蛋白表達(dá)譜,并與尿液的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行比對,探討從尿液中發(fā)現(xiàn)反映膀胱癌惡性轉(zhuǎn)移潛能的生物標(biāo)記組的可能性?,F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料來源

    按照“知情同意”原則收集高、中、低轉(zhuǎn)移潛能浸潤性膀胱癌標(biāo)本各10例。病人因浸潤性膀胱癌在我院治療,在泌尿外科行全膀胱切除術(shù)。術(shù)前均未進(jìn)行化療或放射治療。術(shù)后10 min內(nèi)取腫瘤組織,無菌PBS沖洗后,液氮冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本經(jīng)兩名副高級以上病理學(xué)專家檢查確診,并根據(jù)回顧性分析中的主流統(tǒng)計(jì)學(xué)模型預(yù)測指數(shù)(PI)收集標(biāo)本,根 據(jù)PI的整體分布將病人的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分為3組。

    1.2 激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM)切割腫瘤組織

    LCM使用PixCell Ⅱlaser capture microdissection system 和CapSure LCM Macrocaps (Arcturus Engineering公司),按照文獻(xiàn)描述步驟操作。根據(jù)光鏡下樣本情況及獲得最佳捕獲效率設(shè)定儀器參數(shù):Pulse Duratio 2.0 ms,Beam-Diameter 15 μm,Beam Power 70 mW。每例標(biāo)本捕獲間質(zhì)細(xì)胞25 shootings,顯微鏡下檢查切割所獲得的細(xì)胞群均具有98%的同源性。

    1.3 胰酶蛋白酶酶解蛋白

    酶解蛋白質(zhì)混合物及二維液相色譜分離多肽混合物,經(jīng)LCM技術(shù)處理后放入沉淀溶液中,-20 ℃至少12 h。以含體積分?jǐn)?shù)1.00的丙酮及體積分?jǐn)?shù)0.70的乙醇沖洗片狀沉淀物,采用Bio-Rad protein assay kit檢測可溶性蛋白質(zhì)濃度。二硫蘇糖醇濃縮可溶性蛋白質(zhì)200 μg,最終濃度為20 mmol/L,然后經(jīng)40 mmol/L碘乙酰胺烷基化。Microcon-10超濾去除甲苯胺藍(lán)并且脫鹽后,蛋白質(zhì)混合物中加入測序級胰蛋白酶(蛋白質(zhì)混合物∶測序級胰蛋白酶=1∶30)37 ℃過夜。

    1.4 肽段標(biāo)記

    各組樣品分別取100 μg,按照試劑盒iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進(jìn)行標(biāo)記。用iTRAQ溶解緩沖液溶解;隨后分別在iTRAQ試劑115、116和117內(nèi)各加入60 μL無水乙醇,用處理后的iTRAQ試劑115、116和117分別標(biāo)記高危、中危、低危肽段混合物,室溫條件下反應(yīng)1 h后,把4組標(biāo)記樣品混合,加入10倍體積的SCX上樣緩沖液。

    1.5 SCX分級

    取標(biāo)記后的所有肽段混合,應(yīng)用儀器AKTA Purifier 100(GE Healthcare)進(jìn)行SCX預(yù)分級。收集穿流及洗脫fraction約30份,根據(jù)SCX色譜圖合并成10份,凍干后C18 Cartridge脫鹽。

    1.6 毛細(xì)管高效液相色譜

    每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。

    1.7 質(zhì)譜鑒定

    每份樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan)進(jìn)行質(zhì)譜分析,按照機(jī)器操作步驟說明進(jìn)行操作。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集:每次全掃描后采集10個(gè)碎片圖譜。采用美國Finnigan公司提供的SEQUEST軟件搜索碰撞誘導(dǎo)裂解后的串聯(lián)質(zhì)譜圖。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為IPI human蛋白庫。

    1.8 基因本體論(GO)分析

    對我們研究的差異表達(dá)蛋白譜進(jìn)行深入分析,GO蛋白軟件用于GO濃集-缺失表達(dá)分析獲得的生物學(xué)數(shù)據(jù),對于濃縮分析,我們需要一個(gè)測試數(shù)據(jù)集和一個(gè)GO注釋的包含完整的人類蛋白質(zhì)組的參考集。按照GO網(wǎng)頁上的說明,從EBI GOA 80.0提取出的有關(guān)GO注釋創(chuàng)造出了自定義的GO的參考集。

    1.9 統(tǒng)計(jì)方法

    統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS version 16.0軟件,應(yīng)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較,以P<0.05為差異有顯著性。

    2 結(jié) 果

    2.1 蛋白質(zhì)鑒定

    各組樣本中分別鑒定出蛋白991/964、957/1 022、1 086/979個(gè)。為了揭示間質(zhì)細(xì)胞的遺傳特點(diǎn)并降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜性,我們只分析3組樣本中共表達(dá)的943個(gè)蛋白。差異表達(dá)蛋白中的最大和最小相對分子質(zhì)量分別為5 630和629 090,等電位(PI)分布范圍為3.67~11.36。

    2.2 蛋白質(zhì)濃集-缺失表達(dá)分析

    在943個(gè)蛋白質(zhì)中具有生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分注解的蛋白質(zhì)分別為760、804個(gè)。通過與國際蛋白質(zhì)索引(IPI)的完整列表進(jìn)行對比,生物學(xué)途徑中濃集-缺失的分支術(shù)語為55/11,細(xì)胞成分中濃集-缺失的分支術(shù)語為43/8。

    3 討 論

    膀胱腫瘤轉(zhuǎn)移潛能存在異質(zhì)性,獲得體現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞純系是進(jìn)行本研究的關(guān)鍵步驟,為達(dá)到此目的,我們實(shí)驗(yàn)第一步采取了LCM技術(shù),并獲得足量蛋白進(jìn)行后續(xù)iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析。LCM聯(lián)合iTRAQ技術(shù),最終我們獲得了腫瘤間質(zhì)中943個(gè)差異表達(dá)蛋白,蛋白質(zhì)中具有生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分注解的蛋白質(zhì)分別為760、804個(gè)。其中的部分蛋白已經(jīng)被報(bào)道與膀胱癌轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。例如,F(xiàn)SCN1被證實(shí)在浸潤性膀胱癌組織標(biāo)本及相應(yīng)尿液標(biāo)本中100%過度表達(dá)[4];在高級別及多發(fā)膀胱腫瘤組織中HMOX1 mRNA的表達(dá)顯著高于低級別及單發(fā)者,其可作為預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記[5];應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測膀胱腫瘤組織中蛋白表達(dá)情況,ANXA1表達(dá)顯著增加,其表達(dá)水平與膀胱腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[6]。

    既往研究中已經(jīng)證實(shí),腫瘤間質(zhì)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。人原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞具有多種異質(zhì)性分泌物,其通過ELR+CXC趨化因子高度分泌,作用于CXCR1和CXCR2,從而影響腫瘤的生長和惡化[7]。葡萄膜黑色素瘤5年病死率高達(dá)30%,死因是由于肝臟轉(zhuǎn)移,而腫瘤間質(zhì)高表達(dá)PEDF,可抑制小鼠模型肝轉(zhuǎn)移的進(jìn)展[8]。近期研究結(jié)果顯示,在結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中高表達(dá)轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素11是一個(gè)必要的先決條件[9]。本研究通過檢測高、中、低浸潤性膀胱癌間質(zhì)中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)來判定腫瘤病人轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),為腫瘤的綜合治療提供幫助。

    細(xì)胞增殖、分化、黏附等相關(guān)蛋白的研究一直是腫瘤研究的熱點(diǎn),很多蛋白已經(jīng)被驗(yàn)證同腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示,此類蛋白的表達(dá)差異決定了腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能,并可以用于評判腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。生物學(xué)途徑中,以細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附及細(xì)胞行為為例,對比已發(fā)表文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)這些蛋白的濃集表達(dá)符合惡性腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)。在細(xì)胞增殖過程中,PRDX1在膽囊癌組織中表達(dá)異常,與膽囊癌進(jìn)展及預(yù)后關(guān)系密切[10];在前列腺癌組織中,PEDF通過直接誘導(dǎo)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞遷移和分化成m1型細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤作用[11];KHDR1在鱗狀細(xì)胞癌組織中高度上調(diào),其在膀胱癌的進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用[12]。歐洲腫瘤實(shí)驗(yàn)中心的癌癥臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示,在33例腫瘤病人中檢測到AINX的表達(dá),其可影響間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤化療效果并可作為獨(dú)立的預(yù)后因素[13];CALR表達(dá)水平的變化可能會影響膀胱癌在體外和體內(nèi)的進(jìn)展。以RNA和基質(zhì)金屬蛋白酶2、9為檢測目標(biāo),以提高常規(guī)尿液細(xì)胞學(xué)診斷效能的研究中,MMP9預(yù)測膀胱腫瘤尿細(xì)胞學(xué)靈敏度為90%[14]。這些蛋白密切參與了各類腫瘤的生物學(xué)過程,在腫瘤的細(xì)胞增殖、分化、黏附過程中發(fā)揮作用,在一定程度決定了腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

    根據(jù)GO細(xì)胞組分濃集-缺失分析的定義,濃集的特定蛋白功能活躍,并且該成分的蛋白組更容易通過生物流體研究呈現(xiàn),更可能被確認(rèn)為生物標(biāo)記物。在溶酶體術(shù)語中,已經(jīng)證實(shí)乳癌、肺癌和腦癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中各種溶酶體蛋白高度表達(dá),超過正常水平;核內(nèi)體蛋白CATB在腫瘤細(xì)胞侵犯質(zhì)膜的過程中可降解層粘連蛋白和基底膜成分,從而促進(jìn)腫瘤的浸潤[15]。我們研究的結(jié)果表明,特定蛋白在腫瘤的浸潤過程中功能活躍,可用來作為生物標(biāo)記。

    總之,LCM聯(lián)合iTRAQ法分析不同轉(zhuǎn)移潛能浸潤性膀胱癌間質(zhì)蛋白的表達(dá)譜特征,結(jié)果可靠、有效。細(xì)胞的生物學(xué)途徑和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)決定腫瘤轉(zhuǎn)移潛能,并可以成為潛在的可以從尿液中檢出的生物學(xué)標(biāo)記物。

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