生物殺蟲(chóng)劑球形賴氨酸芽孢桿菌的研究進(jìn)展*

付蒙穎 王 英 鐘 敏 艾國(guó)平

(第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)研究所，重慶 400038)

在過(guò)去的一個(gè)世紀(jì)里，人類成功從昆蟲(chóng)體內(nèi)分離到了多種細(xì)菌，迄今為止研究最為廣泛的是蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis。這些細(xì)菌已經(jīng)證實(shí)非常有效，目前市面上有超過(guò)100種產(chǎn)品用于控制各種農(nóng)作物害蟲(chóng)和能夠傳播人類疾病的蟲(chóng)媒。在過(guò)去的十年中，另一個(gè)殺蟲(chóng)細(xì)菌，球型芽孢桿菌(Bacillussphaericus，Bs)逐漸受到關(guān)注并產(chǎn)生了商業(yè)化的產(chǎn)品，Bs的許多亞種被證實(shí)具有殺滅蚊幼蟲(chóng)的能力。Kellen等(1965)首次報(bào)道了Bs是一種昆蟲(chóng)病原體，盡管這一報(bào)道提示了Bs的重要性，但是直到1973年才認(rèn)識(shí)到Bs可以作為一種殺滅昆蟲(chóng)的生物殺蟲(chóng)劑(Singer, 1973)。從此開(kāi)始，我們對(duì)Bs的研究才有了進(jìn)一步的發(fā)展，包括它的毒性機(jī)制和對(duì)宿主的毒性研究。本文將對(duì)Bs，目前更名為球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus,L.sphaericus)的特性、滅蚊毒素及作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 殺蟲(chóng)活性

自從1965年發(fā)現(xiàn)球形賴氨酸芽孢桿菌具有昆蟲(chóng)致病性以來(lái)，研究表明蚊幼蟲(chóng)是其最主要的靶標(biāo)(Kellenetal., 1965)。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道L.sphaericus對(duì)蛇形毛圓線蟲(chóng)Trichostrongyluscolubriformis等具有不同程度的毒性(Boneetal., 1987)；其毒素Mtx1具有殺滅搖蚊Chironomidae幼蟲(chóng)的能力(Partridgeetal., 2002)；而在注射sphaericolysin后，該毒素蛋白能夠殺滅德國(guó)小蠊(German cockroachBlattelagermanica)及斜紋夜蛾Spodopteralitura( Nishiwakietal., 2007)。除此之外，球形賴氨酸芽孢桿菌還表現(xiàn)出一系列的亞毒性作用包括延緩發(fā)育以及降低繁殖能力，但對(duì)其他生物卻沒(méi)有有害的影響，例如蜜蜂和真核微生物。目前認(rèn)為球形賴氨酸芽孢桿菌的毒力作用譜較窄，因此其具有非常良好的安全使用記錄(Lacey, 2007)。

2 作用機(jī)制

多種球形賴氨酸芽孢桿菌亞株都能產(chǎn)生細(xì)菌素和對(duì)抗其他亞株的抗生素蛋白(抗菌毒素)(Cetinkayaetal., 2003)。下面的部分將對(duì)球形賴氨酸芽孢桿菌的毒性蛋白的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

2.1 Sphaericolysin

Nishiwaki等(2007)從DNA II亞群球形賴氨酸芽孢桿菌 A3-2株中分離到了一種名為Sphaericolysin的蛋白毒素，將其注入德國(guó)小蠊和斜紋夜蛾體內(nèi)，能夠殺死這兩種昆蟲(chóng)。從DNA V亞群球形賴氨酸芽孢桿菌中分離了一種與Sphaericolysin高度同源的一種蛋白毒素，名為膽固醇依賴的細(xì)胞溶素(Cholesterol-dependent cytolysin)( Frometal., 2008)；Sphaericolysin的編碼基因同樣出現(xiàn)在已經(jīng)測(cè)序完成的球形賴氨酸芽孢桿菌 C3-41株基因組中(Huetal., 2008)。因此，我們有理由認(rèn)為，編碼這種毒素蛋白的基因可能分布較廣。研究發(fā)現(xiàn)，Sphaericolysi的成熟蛋白是經(jīng)過(guò)剪切掉N端信號(hào)肽并分泌到培養(yǎng)基中的一個(gè)53 kDa的蛋白(Nishiwakietal., 2007)。它和B.thuringiensis分泌的產(chǎn)氣莢膜梭菌素O (Perfringolysin O)和蜂房桿菌溶素(Alveolysin)同屬于硫醇細(xì)胞溶素超家族。它包括一個(gè)類似于膽固醇依賴細(xì)胞溶素的模體結(jié)構(gòu)，并且在與膽固醇共同注射時(shí)，其滅蟲(chóng)活性顯著性降低。通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌素O類似，能夠使紅細(xì)胞表面產(chǎn)生許多約35 nm直徑的孔洞?？傊延械难芯匡@示，球形賴氨酸芽孢桿菌能夠通過(guò)產(chǎn)生和分泌毒素蛋白Sphaericolysin殺死其宿主。

2.2 營(yíng)養(yǎng)期殺蚊毒素

球形賴氨酸芽孢桿菌在其生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)期也會(huì)分泌具有昆蟲(chóng)毒性的毒素。目前已經(jīng)鑒定出兩類營(yíng)養(yǎng)期殺蚊毒素(Vegetative mosquitocidal toxins，Mtx)，根據(jù)作用機(jī)制可以分為兩類：

2.2.1Mtx1蛋白：Mtx1蛋白首先從弱毒性 SSII-1株中鑒定出來(lái)，然后發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)毒性和弱毒性株中都普遍存在，盡管很多都是以假基因的形式存在(Thanabaluetal., 1991)。早在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期該蛋白就開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，并且球形賴氨酸芽孢桿菌中mtx1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的β-半乳糖苷的生產(chǎn)水平比枯草桿菌低，說(shuō)明不同宿主中調(diào)節(jié)元素的活性是有差異的(Ahmedetal.， 1995)。研究發(fā)現(xiàn)Mtx1蛋白在球形賴氨酸芽孢桿菌中不僅表達(dá)水平較低且不穩(wěn)定(Myersetal., 1978)，可以被一種枯草桿菌蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶sphaericase所降解(Watietal., 1997)。該酶及其降解Mtx1的活性隨后有了進(jìn)一步研究(Yangetal., 2007)，而在DNA亞群V的球形賴氨酸芽孢桿菌中的Mtx1卻有較強(qiáng)的穩(wěn)定性(Thanabaluetal., 1995)。

Mtx1為一個(gè)分子量為100 kDa，N端具有其特征信號(hào)序列結(jié)構(gòu)的蛋白，盡管具有信號(hào)序列，但沒(méi)有證據(jù)證明其會(huì)分泌到培養(yǎng)基中(Thanabaluetal., 1991)。該信號(hào)序列的去除有利于重組該蛋白的表達(dá)，去除后的重組Mtx1蛋白分子量為97 kDa (Thanabaluetal. 1992)。信號(hào)肽樣序列下游區(qū)域與ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶細(xì)菌毒素結(jié)構(gòu)類似。Mtx1會(huì)被存在于蚊中腸中的酶﹑胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶水解，產(chǎn)生一個(gè)約27 kDa包含有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)的分子和一個(gè)約70 kDa包含有內(nèi)部重復(fù)序列的分子(Schirmeretal., 2002a)。這些重復(fù)序列為一個(gè)凝集素樣模體(Lectin-like motif)，其可能參與結(jié)合糖基團(tuán)，因而可能決定了毒素的特異性。Mtx1的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)4個(gè)蓖麻毒素B樣凝集素功能域環(huán)繞著ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以保護(hù)其不被蛋白酶所水解(Treiberetal., 2008)。晶體結(jié)構(gòu)中的活化環(huán)暴露可以使其被蛋白酶水解，以便使凝集素結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)催化結(jié)構(gòu)域被靶細(xì)胞攝取。盡管蚊細(xì)胞中Mtx1的靶標(biāo)仍不清楚，但研究證實(shí)Mtx1會(huì)修飾致倦庫(kù)蚊Cx.quinquefasciatus的某些蛋白﹑Hela細(xì)胞的幾種蛋白﹑E.coli的EF-Tu(Schirmeretal., 2002b)以及大豆胰蛋白酶抑制子，并且都是針對(duì)于精氨酸殘基進(jìn)行修飾(Carpuscaetal., 2006)。Mtx1蛋白C端70 kDa區(qū)域(包含凝集素重復(fù)域)能夠引起致倦庫(kù)蚊和埃及伊蚊Aedesaegypti細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變。但Mtx1水解后的27和70 kDa區(qū)域?qū)τ谄錃⑽枚拘远际潜仨毜?Thanabaluetal., 1993)。在Hela細(xì)胞內(nèi)表達(dá)27 kDa的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域?qū)a(chǎn)生細(xì)胞毒性并導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)類似的絲狀偽足(Schirmeretal., 2002b)。

2.2.2Mtx2蛋白：Mtx2蛋白是從SSII-1株中鑒定出來(lái)與Mtx1不同的另一類毒素蛋白(Thanabaluetal., 1996)。隨后這一家族中的另一成員Mtx3也被報(bào)道(Liuetal., 1996)。這些蛋白是成孔毒素家族的成員，屬于NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)中的梭狀芽胞桿菌ε毒素ETX/MTX2家族。B.thuringiensis同樣能夠產(chǎn)生類似蛋白，包括Cry15Aa (de Maagdetal., 2003)。Mtx2和Mtx3在營(yíng)養(yǎng)期就會(huì)產(chǎn)生，并且對(duì)致倦庫(kù)蚊和埃及伊蚊都有殺傷作用(Liuetal., 1996; Thanabaluetal., 1996 )。Mtx2毒素蛋白的自然突變會(huì)導(dǎo)致對(duì)兩種蚊種的毒性不一樣，224位氨基酸殘基被認(rèn)為在決定靶標(biāo)時(shí)起決定性作用，若該位點(diǎn)為賴氨酸，則表現(xiàn)出對(duì)致乏庫(kù)蚊的毒力更強(qiáng)；若該位點(diǎn)為蘇氨酸則表現(xiàn)出對(duì)埃及伊蚊的毒力更強(qiáng)(Chanetal. 1996)。Mtx2蛋白的C端對(duì)于其溶解性和活可能同樣非常重要(Phannachetetal., 2010)。

2.3 Bin毒素

Bin或Binary毒素儲(chǔ)存在伴胞晶體中，它們被認(rèn)為是強(qiáng)滅蚊活性株的特征。該毒素由兩種蛋白組成：BinA(370個(gè)氨基酸，42 kDa)和BinB(448個(gè)氨基酸，51 kDa)。它們由同一個(gè)操縱子控制同時(shí)轉(zhuǎn)錄，在指數(shù)生長(zhǎng)期以及孢子期之前表達(dá)(Ahmedetal., 1995)，若在孢子形成早期進(jìn)行阻斷，則不會(huì)積累毒素晶體(El-Bendaryetal., 2005)。不同亞株之間的Bin蛋白非常保守，目前僅報(bào)道有5種突變型且任意兩種突變型蛋白序列之間不會(huì)超過(guò)6個(gè)氨基酸的不同(Hireetal., 2009)。Bin毒素蛋白家族的其他成員還包括球形賴氨酸芽孢桿菌的Cry49蛋白；B.thuringiensis的Cry35和Cry36蛋白(Jonesetal., 2007)。對(duì)幼蟲(chóng)的研究發(fā)現(xiàn)，Bin毒素晶體在中腸的堿性環(huán)境中溶解，并進(jìn)行有限的蛋白水解，變成毒性增加的較小分子量的衍生物(Alyetal., 1989, Davidsonetal., 1990)。這一水解過(guò)程在易感和不易感昆蟲(chóng)中都會(huì)發(fā)生(Broadwelletal., 1987)。

最初的毒力作用于昆蟲(chóng)中腸，中毒后的幼蟲(chóng)也會(huì)表現(xiàn)出神經(jīng)核肌肉組織的損傷。在蚊中腸溶解活化后，毒素結(jié)合到庫(kù)蚊胃盲囊和后部中腸的表皮細(xì)胞，按蚊的少量局部細(xì)胞，而不作用于埃及伊蚊(Davidsonetal., 1988, Oeietal., 1992)。結(jié)合至庫(kù)蚊細(xì)胞是由BinB蛋白介導(dǎo)的，其可以獨(dú)自直接結(jié)合到中腸的特定區(qū)域的GPI-錨定麥芽糖酶(GPI-anchored maltase, Cpm1) (Oeietal., 1992, Darbouxetal., 2001)。該毒素還能與按蚊細(xì)胞的刷狀緣膜片段結(jié)合，但在岡比亞按蚊Anophelesgambiae中，BinA可以不需要BinB就可以直接結(jié)合(Charlesetal., 1997)。該蚊種中的Bin蛋白受體也是與Cpm1直接同源的麥芽糖酶，名為Agm1。在埃及伊蚊的另一個(gè)蛋白，與Cpm1和Agm1都高度同源的，但埃及伊蚊卻對(duì)Bin毒素不敏感，暗示這種作用的特異性可以是由高親和力的小作用域所決定的，而這種小的作用域在蚊種間卻不同源(Opotaetal., 2008)。與受體結(jié)合后將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而這一系列反應(yīng)仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)庫(kù)蚊的細(xì)胞被毒素作用后，出現(xiàn)了孔洞。使用人造細(xì)胞膜進(jìn)行試驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果(Boonsermetal., 2006)。說(shuō)明Bin毒素的作用是通過(guò)在細(xì)胞膜上形成孔洞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將克隆的Cpm1基因轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，在Bin毒素的刺激下細(xì)胞表現(xiàn)出孔道的開(kāi)放，液泡的出現(xiàn)，但未發(fā)現(xiàn)裂解(Pauchetetal., 2005)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Bin毒素作用于這些細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)離子通道的開(kāi)放、毒素與其受體的內(nèi)化以及大型液泡的產(chǎn)生。這些液泡并不與內(nèi)化的毒素共位。內(nèi)化的毒素-受體復(fù)合物進(jìn)入吞噬內(nèi)體進(jìn)行降解循環(huán)。一種假設(shè)是孔道的形成可能被p38 分裂激活蛋白激酶所識(shí)別，導(dǎo)致了中腸細(xì)胞的自噬。Bin毒素會(huì)導(dǎo)致液泡產(chǎn)生，但其自己的移動(dòng)卻是區(qū)域化的，并不會(huì)遷移至降解細(xì)胞器中。每一種Bin蛋白引起的毒性作用的意義目前仍然不清楚(Opotaetal., 2011)。由于這兩種細(xì)菌毒素的不同性質(zhì)，引發(fā)了一系列對(duì)于重組毒素的實(shí)驗(yàn)，但這些重組毒素卻沒(méi)有用于野外使用。

3 毒素的協(xié)同作用

營(yíng)養(yǎng)期毒素Mtx1和Mtx2能夠協(xié)同殺傷埃及伊蚊(Rungrodetal., 2009)。同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的Mtx蛋白與孢子期相關(guān)的Bin蛋白也可以聯(lián)合發(fā)揮殺傷作用(Wirthetal., 2007)。在中毒的昆蟲(chóng)中，大多數(shù)球形賴氨酸芽孢桿菌在幼蟲(chóng)死亡的時(shí)候同時(shí)進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期。因此，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期產(chǎn)生的毒素和Bin毒素可能在自然的球形賴氨酸芽孢桿菌感染過(guò)程中相互關(guān)聯(lián)發(fā)揮合作效應(yīng)。Mtx1、Mtx2以及Mtx3是與營(yíng)養(yǎng)期相關(guān)的毒素，并不會(huì)被分泌，早期對(duì)不產(chǎn)生Bin毒素的SSII-1株的研究提示蚊中腸對(duì)細(xì)菌的消化可能是使毒素釋放的原因之一。球形賴氨酸芽孢桿菌toxins和B.thuringiensis毒素的協(xié)同作用也有報(bào)道：Mtx1和Cry11A；Mtx2和Cry11A 或Cyt1A；Bin和Cry4A，Cry4B或Cry11A(Wirthetal., 2004; Wirthetal., 2007)。

4 展望

球形賴氨酸芽孢桿菌已經(jīng)證實(shí)可以作為一種野外使用的高效蚊控生物殺蟲(chóng)劑，盡管有一定的耐受出現(xiàn)。處理這個(gè)潛在的問(wèn)題，例如使用重組毒素或與其他殺蟲(chóng)劑(例如B.thuringiensis)交替使用可以維持球形賴氨酸芽孢桿菌殺蟲(chóng)劑的效用。最近20年，對(duì)球形賴氨酸芽孢桿菌以及它的昆蟲(chóng)致病性的研究取得了巨大的成就，但仍然存在一些問(wèn)題未被闡明。雖然我們能夠在野外通過(guò)使用高密度的孢子來(lái)控制該細(xì)菌的過(guò)度使用，然而對(duì)它的自然生態(tài)學(xué)卻是知之甚少。研究其在自然條件下的持久性和回收利用，從而達(dá)到自然環(huán)境能夠接受的最小細(xì)菌效量，這將會(huì)是一個(gè)非常有意義的工作。盡管從分子水平上已經(jīng)獲得了很多關(guān)于其毒力作用機(jī)制的信息，但很多細(xì)節(jié)仍然是迷。研究表明Bin毒素可以形成孔道，我們便開(kāi)始去理解靶細(xì)胞為什么會(huì)液泡化以及一系列類似的有意義的生理現(xiàn)象。但目前仍未鑒定出Mtx1和Mtx2家族蛋白的受體，蚊細(xì)胞中Mtx1的ADP-核糖基化結(jié)構(gòu)的分子作用靶點(diǎn)也有待進(jìn)一步探索。

重組球形賴氨酸芽孢桿菌或其他表達(dá)其毒素微生物的研究可能會(huì)使該細(xì)菌具有極高的效用，有望在野外降低耐受或延長(zhǎng)耐受產(chǎn)生時(shí)間。我們對(duì)該細(xì)菌及其毒素更深入的認(rèn)識(shí)必將更加有利于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)研究。