模式動物斑馬魚在肝臟發(fā)育、肝癌及肝再生中的研究進展*

張悠然，楊振國，張晶晶1，

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科；2臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湛江524000）

·綜 述·

模式動物斑馬魚在肝臟發(fā)育、肝癌及肝再生中的研究進展*

張悠然1**，楊振國2，張晶晶1，2

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科；2臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湛江524000）

斑馬魚和人類的肝臟在發(fā)育過程與生理病理改變中都有著非常類似的分子機制。斑馬魚在發(fā)育遺傳學(xué)及組織胚胎學(xué)上的特性，決定它可作為研究肝臟發(fā)育、肝癌形成及肝再生的理想模式動物。同時，隨著斑馬魚肝組織特異性疾病模型的建立，它將成為抗肝癌類藥物高通量篩選的工具之一。近年來由于眾多原因使肝功能疾病呈上升趨勢。因此研究肝臟發(fā)育、肝癌形成及肝再生分子機制，成為現(xiàn)在肝臟生理醫(yī)學(xué)研究的熱點。

肝癌；肝臟再生；斑馬魚；模式動物

斑馬魚（Danio rerio）為輻鰭魚綱鯉形目鯉科中的一種，原產(chǎn)于印度、巴基斯坦和孟加拉的河流中。早在1981年Streisinger等便首次提出了利用斑馬魚進行發(fā)育遺傳學(xué)研究的可行性[1]。1996年Nüsslein-Volhard等發(fā)表一系列利用斑馬魚進行大規(guī)模突變體篩選的論文[2]，從此揭開了利用斑馬魚作為模式動物進行發(fā)育與疾病研究的新篇章。斑馬魚具有許多其他模式動物所不具備的明顯優(yōu)勢：體積小、胚胎透明，能在顯微鏡下進行實時觀察；成魚生殖能力強、體外受精等。最重要的一點是其基因與人類基因的相似度大于87%，且作為脊椎動物，其心血管系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)、肝臟等消化系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)等都與人類相應(yīng)的組織具有極其相似的發(fā)育機制與特點，這些都為斑馬魚作為人類疾病模型的建立奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

由于斑馬魚在發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，相應(yīng)的實驗工具及實驗技術(shù)也應(yīng)運而生，如利用嗎啉基寡核苷酸（morpholino）進行基因干擾及沉默技術(shù)[3]、利用tol 2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因技術(shù)等[4]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)使得研究者能夠利用特定基因的啟動子驅(qū)動熒光蛋白在特定組織進行表達，便于對目的研究器官組織進行標記和實時觀察。如將肝脂肪酸結(jié)合蛋白L-FABP的啟動子接上C型肝炎病毒中具有致癌性的HCV核心蛋白，能在斑馬魚肝臟逐漸形成肝癌的3大變化：脂肪肝、纖維化，以及肝癌，因此該技術(shù)也可被廣泛用來研究肝癌的形成機制。

近年來，越來越多的科學(xué)家開展了利用斑馬魚作為動物模型對肝臟發(fā)育、肝癌及肝再生的研究，本文就這幾方面的最新研究進展作一綜述。

1 用斑馬魚進行肝臟發(fā)育的研究

成年斑馬魚的肝臟由兩片肝頁組成，位于斑馬魚背腹軸上，其背側(cè)的肝頁較腹側(cè)的大25%左右，兩片肝頁間無結(jié)締組織相連[5]。作為硬骨魚的一種，斑馬魚肝臟的組織結(jié)構(gòu)與哺乳動物類肝臟具有一些明顯的差別：斑馬魚肝門靜脈、肝動脈和大膽管等隨機分布于肝軟組織中，而哺乳動物則整合在肝門管中；另外，斑馬魚的肝細胞分布成管狀結(jié)構(gòu)包裹在小膽管外圍，而哺乳動物則呈雙層肝板結(jié)構(gòu)分布[6-7]。

Ward等通過原基因分布實驗揭示，斑馬魚成肝細胞起源于早期胚胎發(fā)育中的內(nèi)胚層細胞。位于腹側(cè)的內(nèi)胚層細胞分化為肝芽，而位于背側(cè)的內(nèi)胚層細胞分化為胰腺組織[8]。借助綠色熒光蛋白特異性標記內(nèi)胚層細胞的腸道轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系tg(gutGFP)，F(xiàn)ield等發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎早期肝臟形成可分為芽生期和生長期兩個典型的發(fā)育階段[9]。受精卵發(fā)育24～28小時后，遷移至斑馬魚咽部后方的內(nèi)胚層細胞聚集變厚，趨向于中線左側(cè)彎曲芽生形成肝芽的雛形，在隨后的6～10小時發(fā)育階段內(nèi)，肝管將肝臟與食道、腸道等其它消化器官連接起來完成肝芽的發(fā)生[9-10]；受精卵發(fā)育50～96小時階段為肝臟的生長期，此時肝芽和成肝細胞通過進一步的增殖、分化、形變等形

成肝細胞及膽管細胞以及左右肝頁等[9]。

**[作者簡介]張悠然，女，漢族，河南開封人，生于1989年12月，碩士研究生，研究方向：疾病動物模型。 通信作者：張晶晶，電話：0759-2369582,E-mail:jj.zhang@gdmc.edu.cn。

在斑馬魚早期發(fā)育階段，Wnt2bb,Bmp2b,Fgf, RA等信號分子對成肝細胞特化起決定性作用[11]。Hhex和Prox1等因子對肝芽的形成及成肝細胞的遷移起促進作用[12-14]。浙江大學(xué)彭金榮老師的研究團隊發(fā)現(xiàn)，Prox1，Mypt1，Def，△113P53，Leg1等一系列因子在斑馬魚胚胎肝生長與擴張期中起重要的作用[6，15-16]。另外，其它一些因子也相繼被發(fā)現(xiàn)影響著肝臟的發(fā)育。Klein等發(fā)現(xiàn)，斑馬魚神經(jīng)元導(dǎo)向分子Nav3a能通過指導(dǎo)內(nèi)胚層細胞的遷移，從而影響與內(nèi)胚層細胞相關(guān)器官的發(fā)育，特異性沉默nav3a因子的斑馬魚胚胎在肝芽形成時期，成肝細胞的遷移會受到阻礙，導(dǎo)致生成較小尺寸的肝，同時胰腺及魚鰾等發(fā)育也受到影響[17]。而Wang等研究則發(fā)現(xiàn)，斑馬魚核糖體發(fā)生因子Bms11對胚胎肝臟發(fā)育同樣起重要的作用，Bms11的單氨基酸點突變導(dǎo)致成肝細胞的增殖受阻，bms11 sq163突變斑馬魚肝組織發(fā)育不完全[18]。分選蛋白SNX7在斑馬魚胚胎肝發(fā)育過程中能特異性調(diào)節(jié)肝細胞的存活及凋亡，體外細胞水平實驗表明，SNX7下調(diào)后，誘導(dǎo)細胞凋亡的細胞FLICE-like抑制蛋白(c-FLIP)/Caspase 8信號通路將被激活，斑馬魚體內(nèi)實驗證明，snx7特異性沉默的斑馬魚胚胎中成肝細胞及其增殖均表現(xiàn)正常，但肝細胞在肝芽形成階段大量凋亡，導(dǎo)致肝臟發(fā)育畸形[19]。

2 利用斑馬魚進行肝癌（肝細胞癌）的研究

斑馬魚作為癌癥類疾病模型的研究起始于2000年左右，它通過啟用致癌物質(zhì)刺激來誘導(dǎo)斑馬魚腫瘤的形成。傳統(tǒng)的致癌物質(zhì)有7,12-二甲基苯并[α]蒽,N-亞硝基二甲胺等。研究者利用此類化學(xué)物質(zhì)刺激斑馬魚后成功構(gòu)建了肝、腸、胰腺、卵巢等斑馬魚癌癥模型，然而這種早期的斑馬魚腫瘤誘導(dǎo)方法存在著許多弊端，如腫瘤誘導(dǎo)發(fā)生率較低，非組織特異性腫瘤、個體腫瘤表型存在很大差異等[20-21]。2003年，Langenau等首次利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功構(gòu)建了T-細胞急性淋巴細胞性白血病的斑馬魚模型。該模型的建立開啟了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)構(gòu)建斑馬魚腫瘤模型的新紀元[22]。

2011年，新加坡國立大學(xué)宮知遠研究團隊首次利用肝特異性脂肪酸結(jié)合蛋白FABP10啟動子來驅(qū)動過表達致癌基因krasV12，成功構(gòu)建了第一例肝特異性腫瘤模型[23]。Kras為許多癌癥特別是肝細胞癌常見的致癌基因，krasV12編碼Kras蛋白第12位點的一個單氨基酸殘基點突變。KrasV12突變蛋白在肝組織中的過表達會導(dǎo)致早期胚胎致死和肝細胞癌的形成，斑馬魚肝組織逐步表現(xiàn)為增生、腫瘤細胞II～III級癌化、腫瘤細胞浸潤等。實驗還發(fā)現(xiàn)，將EGFP-KrasV12熒光標記的肝癌細胞移植入野生型斑馬魚成魚中，60天后能同樣導(dǎo)致受體斑馬魚肝癌的發(fā)生，組織學(xué)診斷結(jié)果等驗證了斑馬魚肝特異性腫瘤模型構(gòu)建的成功[23]。在此基礎(chǔ)上宮知遠教授團隊又成功構(gòu)建了條件誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝癌模型，即利用米非司酮誘導(dǎo)和四環(huán)素誘導(dǎo)（Tet-on）技術(shù)在特定時間段誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[24-25]。米非司酮誘導(dǎo)krasV12基因表達1個月后，轉(zhuǎn)基因斑馬魚成功被誘導(dǎo)發(fā)展為肝臟腫瘤。而更有趣的是，當將米非司酮移除后2～4周內(nèi)，斑馬魚肝組織因為癌細胞的死亡導(dǎo)致腫瘤衰退。該模型成功建立了誘導(dǎo)可逆性的轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝癌模型。當利用四環(huán)素誘導(dǎo)技術(shù)在斑馬魚肝臟分別特異性誘導(dǎo)與肝癌相關(guān)的魚類xmrk癌基因和鼠源myc癌基因時，xmrk與myc均能被過量表達，且隨著四環(huán)素處理時間的延長，肝組織表現(xiàn)為增生、惡化，并最終形成肝細胞肝癌[24-26]。

研究發(fā)現(xiàn)，從臨床肝癌患者中檢測出的一些基因突變導(dǎo)致肝癌發(fā)生的因子，其功能在人和斑馬魚中也是高度保守的，如klf6。體外實驗證實，klf6在肝細胞中的過表達導(dǎo)致出生后的肝發(fā)育不全[27]，因此，klf6在胚胎肝生長中可能起著控制細胞增殖的作用。2004年Kremer-Tal等首次檢測與報道41例肝腫瘤細胞中有2例存在klf6的基因突變[28]；同年，Wang等檢測了27例肝腫瘤細胞中有6例與klf6的基因突變相關(guān)[29]。2006年P(guān)an等通過對23例肝癌病例組織中klf6基因的序列分析和Klf6蛋白的表達水平研究，發(fā)現(xiàn)2個與肝癌發(fā)生相關(guān)的klf6基因突變位點，首次揭示Klf6蛋白第162位氨基酸色氨酸W突變?yōu)楦拾彼酖后導(dǎo)致肝細胞的增殖失控[30]。以上病例報道證實Klf6的突變和表達水平的變化與肝癌發(fā)生的相關(guān)性。作為人類klf6[gi:12653091]的同源基因，斑馬魚klf6基因copeb[gi:41393087]所編碼的 Copeb蛋白 [NP_958869]與人類 Klf6蛋白[AAH00311]蛋白序列的一致性為75%，且Klf6蛋白第162位色氨酸W與斑馬魚Copeb蛋白第160位

的色氨酸W在進化上是高度保守的。因此這為利用模式動物斑馬魚作為模型來研究Klf6蛋白及其突變體對肝細胞的增殖、腫瘤發(fā)生、發(fā)展提供堅實的理論基礎(chǔ)。此外，通過將人源肝癌細胞進行異種移植入斑馬魚胚胎中，來研究肝癌細胞的特性也成為目前轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重要技術(shù)方法之一。

3 利用斑馬魚進行肝臟再生的研究

斑馬魚組織器官強大的再生潛能最早發(fā)現(xiàn)于2003年[31]。近年研究表明斑馬魚鰭、心臟、脊髓和視網(wǎng)膜等都具有再生修復(fù)能力。2007年Salder等利用斑馬魚，首次建立肝臟局部切除模型進行肝臟再生研究。結(jié)果表明斑馬魚uhrf1基因作為細胞循環(huán)調(diào)節(jié)因子和top2a的轉(zhuǎn)錄激活因子，對肝臟生長發(fā)育及再生過程起重要作用。斑馬魚胚胎中70%局部被切除肝左葉中uhrf1的表達水平在肝再生過程中明顯升高，top2a的轉(zhuǎn)錄水平也隨之顯著提高。而uhrf1基因敲除的斑馬魚在肝左葉局部切除后其肝臟喪失再生能力[5]。除此之外還有許多與斑馬魚肝再生相關(guān)的因子，如肝細胞生成素（hepatopoietin，也稱Augmenter of Liver Regeneration）[32]，結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白[33]等，他們對斑馬魚肝臟發(fā)育和再生同樣起著重要的作用。如果利用tg（lfabp:egfp）等肝特異性轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，借助單細胞激光淬滅以及激光顯微切割等技術(shù)，則可在胚胎發(fā)育早期對肝組織實行局部切除，研究肝再生相關(guān)因子的發(fā)育學(xué)功能。

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R-332

B

廣東省自然科學(xué)基金（S2012010008245），廣東省科技計劃項目（2012B060300026），廣東省高等學(xué)校人才引進專項資金（粵財教〔2012〕328號）項目。

2014-05-14

1006-2440（2014）04-0337-04