加壓提取三七總皂苷體外抗氧化活性成分研究

★ 羅頌武 張旭紅

(1.廣州市紅十字會醫(yī)院藥學(xué)部 廣東 廣州 510240；2. 廣東藥學(xué)院 廣東 廣州 510006)

三七(Radix Notoginsen)又名田七，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，明代著名的藥學(xué)家李時(shí)珍稱其為“金不換”。三七入藥歷史悠久，具有散瘀止血、消腫定痛之功效。三七總皂苷是三七主要活性成分，研究表明，皂苷類成分具有抗衰老、降血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等廣泛的藥理效應(yīng)，這主要與皂苷類成分可清除自由基，具有抗氧化活性有關(guān)[1]。加壓提取是一項(xiàng)新的提取技術(shù)，適用于大部分中藥材[2,3]。在加壓提取中藥有效成分的過程中，因施加了一定的壓力，在高于沸點(diǎn)時(shí)，溶劑仍保持液體狀態(tài)，使溶劑的溶解性得到改善，同時(shí)，可促使藥材的細(xì)胞壁破裂，其中有效成分的溶出速率加快，明顯增加藥材有效成分的提取率[4]。本研究采用DPPH法研究加壓提取皂苷成分體外抗氧化活性，考察加壓提取技術(shù)對有效成分活性的影響，以期為加壓提取技術(shù)提取三七總皂苷提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 三七塊根(購自廣州市醫(yī)藥公司)。

1.2 試劑 三七皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110745-200312)；DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)(sigma公司)；乙醇、甲醇香草醛、高氯酸、冰醋酸等均為分析純。

1.3 儀器 紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用，型號：TU-1800)；高壓磁力攪拌反應(yīng)釜(煙臺科立化工設(shè)備有限公司，型號：PCF-1)；電子天平(賽多利斯，型號：KY-GSA124S)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮，型號：RE-3000)。

2 方法

2.1 三七總皂苷提取法

2.1.1 加壓提取法 稱取三七干燥粗粉20g,倒入加壓提取器中，加50%乙醇(料液比1∶10),于壓力4.5kg/cm2、溫度60℃下密封加壓提取，時(shí)間1h，濃縮，揮干溶劑得浸膏備用。

2.1.2 醇回流法 稱取三七干燥粗粉20g,加50%乙醇(料液比1∶10)，采用回流法提取，1h/次,共提取2次,合并濾液,濃縮,揮干溶劑得浸膏備用。

2.2 三七總皂苷測定

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取精制三七總皂苷樣品24.8mg，置于25mL容量瓶中,加甲醇液至刻度并充分溶解，即得供試品溶液(每mL含樣品0.992mg)。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品三七皂苷Rg12.48mg，置于25mL量瓶中,加甲醇液至刻度并充分溶解，即得對照品溶液(每mL含對照品三七皂苷0.0992mg)。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL對照品溶液,揮干溶劑，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL。取高氯酸0.8mL，置60℃水浴中加熱20min，取出，立即于冷水中冷卻，加入5.0mL冰醋酸搖勻。相應(yīng)試劑隨行空白對照,在最大吸收波長560nm處測定吸收度A,以三七皂苷Rg1含量(mg)為橫坐標(biāo),吸收度A為縱坐標(biāo),求回歸方程為:Y=5.270X+0.0511,r=0.9995。結(jié)果表明：三七皂苷Rg1在0.02425～0.12125mg之間有良好線性關(guān)系。

2.2.4 檢測波長的選擇 吸取標(biāo)準(zhǔn)液,按2.2.3項(xiàng)方法顯色,以紫外分光光度計(jì)掃描(200～800nm),最大吸收波長(即檢測波長)為560nm。

2.3 體外抗氧化活性成分測定 取甲醇稀釋上述備用提取物至一定濃度待測。按表1加樣，靜置30min。分別于最大波長517nm處測定吸收度(A)。平行檢測3次，取其平均值。按公式計(jì)算清除率Y=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%(Ai為加入樣品溶液后DPPH溶液的吸光度；Aj為樣品溶液與DPPH溶液混合后的吸光度；A0為未加樣品溶液時(shí)DPPH溶液的吸光度)。

3 結(jié)果

不同提取法提取的三七總皂苷含量分別為：醇回流法7.45%、加壓提取法8.02%。醇回流法提取的提取物對自由基的清除率為61.4%，采用加壓提取技術(shù)提取的提取物對自由基的清除率為65.9%。

4 討論

加壓提取是一項(xiàng)新興的提取技術(shù)，具有提取時(shí)間短、溶劑消耗少、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。但由于加壓提取是在加壓加熱條件下進(jìn)行，可能造成所得有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而影響生物活性。因此，加壓提取技術(shù)應(yīng)用于中藥材的開發(fā)，探討其對中藥材有效成分生物活性的影響十分重要。

含三萜類皂苷的提取物對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。從結(jié)構(gòu)上分析，DPPH是一種以氮原子為中心的自由基，其穩(wěn)定性主要來自共振穩(wěn)定作用及3個(gè)苯環(huán)的空間障礙，使結(jié)構(gòu)中的氮原子上不成對電子不易發(fā)揮電子成對作用。三萜類皂苷作為自由基清除劑，其結(jié)構(gòu)中的取代基多于甾體類皂苷，單電子易與氮原子配對，破壞DPPH自由基結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用[5]。

本研究結(jié)果顯示，加壓提取法提取物中三七總皂苷含量高于醇回流法，對自由基的清除率略有提高。因此，與醇回流提取相比，加壓提取不影響皂苷類成分的抗氧化活性。加壓提取法提取物對自由基的清除率高于醇回流提取物的原因可能是，加壓提取法提取物中三七總皂苷含量高于醇回流法，具有抗氧化活性的成分含量增多，自由基清除率也隨之增強(qiáng),其物質(zhì)基礎(chǔ)有待于進(jìn)一步研究。

[1]岳莉，趙文英，黃巧燕，等.加壓提取對皂苷類成分抗氧化及抑菌活性的影響[J]. 青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011，32(4)：375-378.

[2]ANEKPANKUL T，GOTO M，SASAKI M. Extraction ofanti-cancer damnacanthal from roots of Morinda citrifolia by subcritical water[J]. Separation and Purification Technology，2007，55:343-349.

[3]楊薇薇，張永忠，李成剛，等.加壓提取紅三葉草總異黃酮的研究[J]. 中草藥，2009，40(9)：1 406-1 407.

[4]李鵬，李紹平，付超美，等.加壓溶劑提取技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J]. 中國中藥雜志，2004，29(8):723-726.

[5]許申鴻，杭瑚．溶劑及pH值對1，1-二苯基-2-苦肼基自由基分析法的影響[J]. 分析測試學(xué)報(bào)，2000，19(3)：50-52.