微量梯形板在Rh表型抗原自動化檢測中的應用

王麗，連云，趙向東，李浩，朱陽泉

（鎮(zhèn)江市中心血站輸血研究室，江蘇鎮(zhèn)江212004）

微量梯形板在Rh表型抗原自動化檢測中的應用

王麗，連云，趙向東，李浩，朱陽泉*

（鎮(zhèn)江市中心血站輸血研究室，江蘇鎮(zhèn)江212004）

目的：探討微量梯形板在Rh表型抗原自動化檢測中的應用效果。方法：在Xantus雙機械臂加樣儀及AK03B數(shù)字血型儀組成的全自動血型檢測平臺上，每批布局8塊微量梯形板，每塊微板檢測24份血樣。編制加樣程序，優(yōu)化相關檢測參數(shù)，同時檢測1 198份隨機獻血者血樣及5份Rh（D）陰性固定獻血者血樣的Rh表型抗原（C、c、D、E、e）。結果：在被檢血樣紅細胞稀釋濃度為2%、5種檢測試劑（IgM抗-C、c、D、E、e）分別稀釋20倍（最終效價為1∶6．4）、室溫靜置反應時間為40 min等條件下，與試管法比較，1 203份血樣Rh表型自動化檢測結果符合率為100%。結論：微量梯形板用于Rh表型抗原檢測可以實現(xiàn)自動化，適用于大批量標本檢測。該方法具有快速準確、試劑耗量低、結果便于電腦統(tǒng)計管理等優(yōu)點。

微量梯形板；Rh表型抗原；聯(lián)合檢測；自動化

Rh血型在臨床輸血及新生兒溶血病診治中具有重要意義。Rh血型系統(tǒng)有5個重要抗原，即C、c、D、E、e，目前檢測方法以手工試管法和卡式法為主，兩者檢測試劑成本較高，且速度慢，不適用于大批量標本。120孔微量梯形板是奧林巴斯公司研制的專用于血型試驗的高科技產(chǎn)品，通過紅細胞與相應抗體在微量梯形孔中的自然沉降反應，紅細胞在抗體的橋聯(lián)和自然重力作用下平鋪于V型梯形孔的底部，形成相對均勻的紅細胞層面；如果紅細胞未與相應抗體結合，則在重力作用下滑落于梯型微孔底部中央形成一個致密的圓點。通過血型儀對微孔底部自動掃描成像，由判讀程序對圖像快速分析，準確得出結果，從而實現(xiàn)檢測過程自動化。

1 材料和方法

1．1 標本來源

1 203份血樣（其中有5份為應急招募的Rh陰性固定獻血者血樣）均來自鎮(zhèn)江地區(qū)無償獻血者，每份血樣容量為3～5 mL，EDTA-K2充分抗凝，檢測前3 000×g離心6 min。

1．2 儀器與試劑

120孔微量梯形板（日本Olympus公司）、Xantus雙機械臂全自動加樣儀與AK03B數(shù)字血型儀組成的全自動血型檢測平臺（深圳愛康電子有限公司），紅細胞稀釋板（深圳愛康電子有限公司），單克隆IgM抗-C、抗-c、抗-E、抗-e試劑（英國Millipore公司），單克隆IgM抗-D試劑（加拿大Dominion公司）。

1．3 方法

1．3．1 布局檢測平臺 在Xantus雙機械臂全自動血型檢測平臺上，布局8塊120孔微量梯形板，每份標本5個Rh抗原的檢測分別占用5個微孔，每塊微板可檢測24（120／5）份標本，每批最多可檢測192（8×24）份標本。

1．3．2 編制檢測程序 取一定量生理鹽水＋被檢血樣壓積紅細胞于稀釋板上充分混勻，得稀釋被檢紅細胞，吸取125μL相應濃度紅細胞于梯形微板的5個檢測微孔中，每孔分配25μL；再分別吸取經(jīng)預稀釋的5種Rh血型試劑25μL于對應的5個孔中。設置后機械臂自動夾取微板在振蕩器上中速混勻10 s，原位室溫靜置40 min。設置血型儀自動掃描判讀：紅細胞均勻分布在V型孔底的判為陽性，紅細胞集中沉降于孔底中央的判為陰性。

1．3．3 優(yōu)化相關檢測參數(shù) 吸取生理鹽水量分別為990、490、320μL，被檢血樣壓積紅細胞各10μL，得紅細胞濃度分別為1%、2%和3%。用生理鹽水對試劑原液進行10倍、20倍及30倍預稀釋（原效價1∶128），稀釋后效價分別為1∶12．8、1∶6．4及1∶4．3。每孔加入反應液的總量參考文獻［1］，以充滿微孔V型底部容積為宜。測量微孔V型底部的容積約為50μL，加被檢稀釋紅細胞和預稀釋試劑各25μL。

2 結果

2．1 微板底部掃描結果

經(jīng)自然沉降反應后，不同反應結果微孔底部掃描圖像見圖1，抗體過量或反應時間過長、抗體不足等均可能造成假陰性結果。

2．2 被檢血樣表型結果

被檢紅細胞與5種抗體反應格局可得18種表型結果，1 203份獻血者血樣共檢出12種表型，分布情況見表1，其中10例Rh陰性經(jīng)確認試驗均符合。

2．3 紅細胞與抗體濃度的優(yōu)化

不同濃度被檢紅細胞與不同效價抗體進行雙盲試驗，檢測1 203份獻血者血樣Rh表型抗原。與試管法結果比較，當被檢紅細胞濃度為2%，試劑效價為1∶6．4時，5種表型結果符合率均為100%，見表2。

3 討論

Rh血型系統(tǒng)是已知人類最具廣泛多態(tài)性和產(chǎn)生免疫性的系統(tǒng)之一，其重要性僅次于ABO血型系統(tǒng)。Rh血型系統(tǒng)有45種不同的抗原，其中有5個抗原免疫原性較強，即D、E、c、C及e。根據(jù)紅細胞上有無D抗原，將其分為Rh陽性和Rh陰性［2］。我國漢族人群Rh陰性比例極低，只占0．34%，因此臨床上抗-D引起的溶血性輸血反應和新生兒溶血病并不多見。近年來，隨著臨床用血量的增加，Rh系統(tǒng)的其他4個抗原引起的溶血性輸血反應和新生兒溶血病屢見報道［3－4］。特別是E和c，在漢族人群中占有較高的頻率［5］，因此臨床上約有50%的輸血為E和c的不合性輸血。E和c的不合性輸血，特別是多次或大量的輸血，易導致患者產(chǎn)生抗-E和抗-c，如再次輸血就可能產(chǎn)生嚴重的溶血性輸血反應。孕婦產(chǎn)生抗-E和抗-c易造成胎兒或新生兒嚴重的溶血?。?］。因此，對于一些需反復輸血的特殊患者和有生育能力的女性患者，Rh表型相合輸血可以避免產(chǎn)生同種免疫性抗體。

目前Rh表型檢測常用的方法有鹽水試管法和微柱凝膠法。面對大量患者和獻血者，同時檢測5個抗原，這兩種方法工作量大、操作煩瑣且檢測成本高，手工記錄易出錯。微量梯形板技術的運用，徹底解決了手工法檢測血型的不足，微孔的底部根據(jù)紅細胞直徑設計了特有的階梯形，每個階梯的寬度與紅細胞直徑相當，便于橋聯(lián)紅細胞的平鋪，沒有抗體橋聯(lián)的紅細胞則滑落孔底。通過軟件對微孔底部成像的快速分析判斷得出準確的檢測結果。因微量梯形板對結果的判斷采用了特有的底部成像技術，因此輕中度的溶血和脂血標本對檢測結果無影響。

微孔底部采用了V字型梯形結構，對于陽性反應孔，最佳的平面掃描圖像中紅細胞平鋪于微孔底部；當紅細胞濃度和反應體積一定時，最佳結果主要取決于反應液中抗體的效價。效價過高，紅細胞將凝集成小塊滑落孔底造成假陰性；效價過低，紅細胞不能形成均一的橋聯(lián)，則有部分紅細胞沉于孔底，仍造成結果的假陰性。因此，要得到理想的檢測結果，必須對試劑原液和被檢紅細胞用生理鹽水作不同程度稀釋后進行交叉試驗。

由于本法有較高的靈敏度，微板的防污染不可輕視，一般采用配制清潔液浸泡過夜，加樣儀使用一次性加樣針可避免污染問題。

［1］ 彭小華，何婧婷，李麗平．120孔梯形微板法血型自動檢測技術的應用［J］．實驗與檢驗醫(yī)學，2011，29（4）：377－378．

［2］ 高峰．臨床輸血與檢驗［M］．2版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：70－72．

［3］ 劉開良，李寧，李碧娟，等．患者紅細胞不規(guī)則同種抗體分析與臨床意義的探討［J］．中國輸血雜志，2011，24（9）：787－789．

［4］ 楊世明，張勇萍，安寧，等．新生兒溶血病紅細胞血型免疫性抗體的特異性分析［J］．細胞與分子免疫學雜志，2011，27（10）：1130－1131．

［5］ 王玲．部分人群中Rh血型C、E抗原分布及意義［J］．臨床檢驗雜志，2010，28（5）：371．

［6］ 岳曉紅．IgG類抗-E致新生兒溶血病4例分析［J］．臨床檢驗雜志，2010，28（3）：209－214．

R457．11

B

1671－7783（2014）06－0520－02

10．13312／j．issn．1671-7783．y140191

鎮(zhèn)江市社會發(fā)展計劃項目（SH2013098）

*：通訊作者，E-mail：yangquanzhu＠aliyun．com

2014－07－08 ［編輯］ 何承志