H3受體激動劑對變應(yīng)性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子含量的影響

竇毅，楊旭東，黃秋生

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

H3受體激動劑對變應(yīng)性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子含量的影響

竇毅，楊旭東，黃秋生

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：探索組胺H3受體激動劑IMETIT對變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）模型豚鼠嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子含量的影響。方法：30只豚鼠隨機(jī)均分為3組，分別為對照組、致敏組、藥物處理組。對照組以生理鹽水，另2組以卵清蛋白為致敏原，復(fù)制AR模型，3組均以1%卵清蛋白生理鹽水溶液滴雙鼻激發(fā)，記錄30 min內(nèi)噴嚏、撓鼻次數(shù)。AR模型建立后，對照組、致敏組、藥物處理組分別以生理鹽水（10 mL／kg）、生理鹽水（10 mL／kg）、生理鹽水（10 mL／kg）＋I(xiàn)METIT（30 mg／kg）灌胃，每天1次，連續(xù)5 d，處死。取鼻中隔黏膜組織行HE染色，觀察嗜酸性粒細(xì)胞浸潤程度；免疫組織化學(xué)法檢測嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子含量。結(jié)果：致敏組和藥物處理組30 min內(nèi)噴嚏次數(shù)分別為20．90±4．88、23．10±4．59，30 min內(nèi)撓鼻次數(shù)分別為26．80±4．80、25．00±3．80，均明顯高于對照組（P均＝0．000）。致敏組、藥物處理組每高倍視野下嗜酸性粒細(xì)胞浸潤數(shù)分別為21．60±4．23、22．37±3．08，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子陽性表達(dá)率分別為（30．16±3．09）%、（29．60±2．88）%，兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P分別為0．581和0．676）。結(jié)論：IMETIT不能減少AR模型豚鼠鼻中隔黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子含量。

H3受體激動劑；變應(yīng)性鼻炎；嗜酸性粒細(xì)胞；嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）即過敏性鼻炎，是機(jī)體接觸變應(yīng)原后主要由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性炎性疾病。嗜酸性粒細(xì)胞浸潤增多是AR病理學(xué)特征之一，其參與許多病理生理過程，特別是變應(yīng)性炎癥反應(yīng)的過程。迄今為止，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子eotaxin是已知的作用和選擇性最強(qiáng)的嗜酸性粒細(xì)胞趨化有關(guān)的因子。燕志強(qiáng)等［1］研究發(fā)現(xiàn)，AR豚鼠鼻腔黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且與鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和活化呈正相關(guān)。我們之前實驗提示，H3受體激動劑IMETIT能緩解AR模型豚鼠噴嚏、流涕、撓鼻（鼻周陣發(fā)性劇烈的前爪搔抓）等典型AR癥狀，減輕鼻中隔黏膜病理改變，可能與豚鼠鼻黏膜P物質(zhì)陽性細(xì)胞數(shù)減少、調(diào)低P物質(zhì)受體mRNA表達(dá)有關(guān)［2］。為此，本實驗采用卵清蛋白致敏方法制備AR模型豚鼠，觀察IMETIT對其鼻中隔黏膜嗜酸性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的影響，探討IMETIT在AR中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與分組

清潔級成年豚鼠30只雌雄各半，體質(zhì)量300～350 g，由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（蘇）2009－0002。隨機(jī)均分為對照組、致敏組和藥物處理組。

1．2 試劑及藥品

氫氧化鋁粉（上海實驗試劑公司）；IMETIT、卵清蛋白（V級）、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子一抗及免疫組化試劑盒［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］。

1．3 動物模型的制備及處理

［2］，致敏組、藥物處理組用卵清蛋白作致敏源制備AR模型，對照組以生理鹽水代替卵清蛋白作對照，3組均以1%卵清蛋白生理鹽水溶液滴雙鼻激發(fā)。記錄30 min內(nèi)各組豚鼠噴嚏、撓鼻次數(shù)。成功的AR模型能激發(fā)出噴嚏、流涕、撓鼻（鼻周陣發(fā)性劇烈的前爪搔抓）等典型AR癥狀。

AR模型建立成功后，對照組、致敏組、藥物處理組分別以生理鹽水（10 mL／kg）、生理鹽水（10 mL／kg）、生理鹽水（10 mL／kg）＋I(xiàn)METIT（30 mg／kg）灌胃，每天1次，連續(xù)5 d。灌胃第3天藥物處理組豚鼠死亡1只。3組豚鼠每天灌胃后2 h以 1%卵清蛋白生理鹽水溶液鼻腔激發(fā)，于末次灌胃激發(fā)后1 h以戊巴比妥鈉溶液（40 mg／kg）腹腔注射麻醉，處死，取一側(cè)鼻中隔黏膜，10%甲醛溶液固定24 h備用。

1．4 嗜酸性粒細(xì)胞浸潤的觀察

取已固定的鼻中隔黏膜組織做常規(guī)石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野，計算每個高倍視野下嗜酸性粒細(xì)胞浸潤數(shù)，用以反映鼻中隔黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤程度。

1．5 免疫組織化學(xué)法檢測嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子

切片脫蠟至水，0．01 mol／L（pH＝6．0）檸檬酸鹽溶液熱修復(fù)，冷卻至常溫；PBS洗3次，每次3 min；加3%過氧化氫，室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS洗3次，每次3 min；正常血清室溫封閉20 min，去除多余血清；滴加一抗（1∶100），4℃過夜；PBS洗3次，每次3 min；滴加二抗，室溫孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；滴加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～4 min；自來水洗，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察，控制染色時間，約1 min，常規(guī)脫水封片。

陽性對照為嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子標(biāo)準(zhǔn)品，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子陽性表達(dá)為胞質(zhì)、胞核呈棕色，胞質(zhì)內(nèi)、組織間隙有棕色顆粒樣物。陰性對照為未經(jīng)一抗處理切片。全自動顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（數(shù)碼相機(jī)，Leica全自動顯微鏡，Qwin軟件）隨機(jī)選取3個高倍視野，計算每個高倍視野下鼻中隔黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子平均陽性表達(dá)率，統(tǒng)計結(jié)果。

1．5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2．1 AR模型癥狀

對照組、致敏組和藥物處理組30 min內(nèi)噴嚏次數(shù)分別為1．10±0．99、20．90±4．88、23．10±4．59（F＝89．14，P＝0．000）；致敏組、藥物處理組均明顯高于對照組（P均＝0．000），致敏組與藥物處理組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．236）。對照組、致敏組和藥物處理組30 min內(nèi)撓鼻次數(shù)分別為0．60± 0．69、26．80±4．80、25．00±3．80（F＝169．08，P＝0．000）；致敏組、藥物處理組均明顯高于對照組（P均＝0．000），致敏組與藥物處理組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．286）。結(jié)果表明，致敏組、藥物處理組豚鼠AR模型建立成功。

2．2 IMETIT對豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤的影響

結(jié)果顯示，對照組、致敏組和藥物處理組每高倍視野下嗜酸性粒細(xì)胞浸潤數(shù)分別為0．57±0．38、21．60±4．23、22．37±3．08（F＝164．12，P＝0．000）；致敏組與藥物處理組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．581）。由圖1可見，對照組無明顯嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，致敏組嗜酸性粒細(xì)胞浸潤明顯，藥物處理組嗜酸性粒細(xì)胞浸潤較致敏組未見明顯減少。

2．3 IMETIT對鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的影響

對照組、致敏組和藥物處理組鼻中隔黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子陽性表達(dá)率分別為（10．50± 2．51）%、（30．16±3．09）%、（29．60±2．88）%（F＝152．80，P＝0．000）；致敏組與藥物處理組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．676）。如圖2所示，對照組嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子陽性染色物質(zhì)表達(dá)明顯少，密度??；致敏組嗜酸性粒細(xì)胞陽性染色物質(zhì)明顯多，密度大；藥物處理組嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子陽性染色物質(zhì)較致敏組未見明顯減少。

3 討論

AR屬Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，發(fā)病過程不僅有肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等多種細(xì)胞參與，還有多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)參與。AR與組胺及其受體密切相關(guān)。Nakaya等［3］發(fā)現(xiàn)人鼻腔黏膜表達(dá)4種組胺受體，此為H3受體激動劑對AR的作用提供了依據(jù)。IMETIT是高親和力的H3受體激動劑［4］，故本實驗中我們用IMETIT給豚鼠灌胃后觀察其對AR模型豚鼠鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的影響。

本實驗采用卵清蛋白制作AR模型，致敏及藥物處理組豚鼠均激發(fā)出典型的AR癥狀，表明成功復(fù)制出豚鼠AR模型。研究表明，嗜酸性粒細(xì)胞在AR患者鼻黏膜中大量聚集，在各種過敏性疾病的病理生理過程中起著重要作用［5］。Oliveira等［6］報道，呼吸道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞的聚集和活化程度與呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，并且其活化產(chǎn)物可活化自身及其他白細(xì)胞等，進(jìn)而釋放更多的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，從而加重炎癥反應(yīng)。Yokota等［7］研究發(fā)現(xiàn)，即使在大劑量情況下，亦未觀測到H3受體激動劑——Sch 50971對AR模型小鼠鼻腔黏膜嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤產(chǎn)生影響，此外，體外研究發(fā)現(xiàn)，H3受體激動劑也不能誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞趨化、變形，不能上調(diào)黏附分子［8］。本研究表明，IMETIT不能減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、聚集，與之相似。Nakayama等［9］還報道，人類和小鼠嗜酸性粒細(xì)胞不表達(dá)H3受體，豚鼠嗜酸性粒細(xì)胞是否也不表達(dá)有待研究。嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子屬于CC類趨化因子亞家族，目前已發(fā)現(xiàn)有3種亞型，分別為eotaxin-1， eotaxin-2和eotaxin-3，它們功能相似，通過與CC趨化因子受體-3結(jié)合后選擇性地趨化、激活嗜酸性粒細(xì)胞［10］，促使嗜酸性粒細(xì)胞合成白三烯C4、產(chǎn)生活性氧簇、脫顆粒釋放炎性介質(zhì)等［11］，在變態(tài)反應(yīng)發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果顯示，IMETIT灌胃后，AR模型豚鼠鼻中隔黏膜嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子含量無明顯降低，表明IMETIT不能抑制嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子在黏膜中的產(chǎn)生、聚集，但我們前期發(fā)現(xiàn)經(jīng)IMETIT灌胃后，AR模型豚鼠撓鼻、噴嚏次數(shù)明顯減少，病理檢查顯示鼻中隔黏膜纖毛倒伏、紊亂、壞死、腺體增生、血管擴(kuò)張及黏膜下間質(zhì)水腫等病理改變明顯減輕［2］，表明IMETIT不是通過減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、聚集及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子在黏膜中的產(chǎn)生、聚集來參與變態(tài)反應(yīng)，至于具體機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

［參考文獻(xiàn)］

［1］ 燕志強(qiáng)，章如新，余少卿，等．嗜酸細(xì)胞活化趨化因子在變應(yīng)性鼻炎中的作用［J］．中國耳鼻咽喉頭頸外科，2008，15（5）：262－266．

［2］ 楊旭東，孫光明，許學(xué)谷，等．組胺H3受體激動劑IMETIT對豚鼠變應(yīng)性鼻炎作用的初步探討［J］．臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，24（12）：559－563．

［3］ Nakaya M，F(xiàn)ukushima Y，TakeuchiN，et al．Nasal allergic response mediated by histamine H3receptors in murine allergic rhinitis［J］．Laryngoscope，2005，115（10）：1778－1784．

［4］ van der Goot H，Timmerman H．Selective ligands as tools to study histamine receptors［J］．Eur JMed Chem，2000，35（1）：5－20．

［5］ Gleich GJ．Mechanisms of eosinophil-associated inflammation［J］．J Allergy Clin Immunol，2000，105（4）：651－663．

［6］ Oliveira SH，Lukacs NW．The role of chemokines and chemokine receptors in eosinophil activation during inflammatory allergic reactions［J］．Braz JMed Biol Res，2003，36（11）：1455－1463．

［7］ Yokota E，Kuyama S，Sugimoto Y，et al．Participation of histamine H3receptors in experimental allergic rhinitis of mice［J］．JPharmacol Sci，2008，108（2）：206－211．

［8］ Ling P，Ngo K，Nguyen S，et al．Histamine H4receptor mediates eosinophil chemotaxis with cell shape change and adhesion molecule upregulation［J］．Br J Pharmacol，2004，142（1）：161－171．

［9］ Nakayama T，Kato Y，Hieshima K，et al．Liver-expressed chemokine／CC chemokine ligand 16 attracts eosinophils by interacting with histamine H4receptor［J］．J Immunol，2004，173（3）：2078－2083．

［10］ Forssmann U，Uguccioni M，Loetscher P，et al．Eotaxin-2，a novel CC chemokine that is selective for the chemokine receptor CCR3，and acts like eotaxin on human eosinophil and basophil leukocytes［J］．J Exp Med，1997，185（12）：2171－2176．

［11］ Bandeira-Melo C，Herbst A，Weller PF．Eotaxins．Contributing to the diversity of eosinophil recruitment and activation［J］．Am JRespir Cell Mol Biol，2001，24（6）：653－657．

［12］ 孫光明，楊旭東，許學(xué)谷，等．組胺H3受體激動劑IMETIT對變應(yīng)性鼻炎豚鼠P物質(zhì)及其受體mRNA表達(dá)的影響［J］．中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，45（6）：465－470．

Effect of H3receptor agonist on eosinophils and eotaxin of allergic rhinitis in guinea pigs

DOU Yi，YANG Xu-dong，HUANG Qiu-sheng
（Department of Otorhinolaryngology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To explore the influence of histamine receptor3（H3R）agonist，IMETIT，on eosinophils and one of eosinophilic chemokines（eotaxin）in allergic rhinitis（AR）model using guinea pigs．M ethods：Thirty guinea pigswere random ly divided into three groups：control group，sensitized group without treatment and sensitized group with drug treatment．The sensitized group with or without drug treatment were immunized by ovalbumin（OVA）to establish AR model and the control group by saline to contrast，then they were stimulated intranasal by ovalbumin（1%）respectively．The times of sneezing and scratching nose in 30min were recorded．The control group and the sensitized group without treatmentwere given gastric gavage by saline．And the sensitized group with drug treatmentwere given gastric gavage by saline（10 mL／kg）with IMETIT（30mg／kg）．Then we investigated the eosinophil infiltration degrees and eosinophilc chemokines content in nasal septum mucosa using HE staining and immunohistochemistry technology．Results：There was significant difference between the control group and the sensitized group with or without drug treatment in the numbers of sneezing and the numbers of scratching nose（P＝0．000）．There was no significant difference between the sensitized group with or without drug treatment in themeans of eosinophil and eotaxin positive expression rate in nasal septum mucosa（P＝0．581，0．676）．Conclusion：The eosinophil infiltration and the level of eotaxin of nasal septum mucous could not be reduced by histamine H3re-ceptor agonist，IMETIT．

H3receptor agonist；allergic rhinitis；eosinophil；eotaxin

R765．21

A

1671－7783（2014）06－0474－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140187

江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金資助項目（JLY20120165）

竇毅（1967—），男，江蘇睢寧人，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉疾病的研究。

2014－07－02 ［編輯］ 劉星星