針刺介入時(shí)機(jī)對腦梗死大鼠能量代謝和腦源性神經(jīng)生長因子、酪氨酸激酶受體B的影響

劉勇，趙軍，王洪，張韌

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

針刺療法廣泛地應(yīng)用于腦梗死的臨床治療，具有擴(kuò)張血管、改善腦及肢體的血液循環(huán)、激活神經(jīng)細(xì)胞、使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能恢復(fù)等作用。研究表明，針刺可促進(jìn)腦梗死患者神經(jīng)功能的康復(fù)，而且開始治療越早越好，但最佳時(shí)間點(diǎn)尚無定論［1］。本研究采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大鼠局灶性永久性大腦中動(dòng)脈阻塞模型(pMCAO)，設(shè)立不同時(shí)間點(diǎn)開始針刺治療，討論不同時(shí)間點(diǎn)給予針刺治療對腦梗死大鼠腦組織的能量代謝及腦源性神經(jīng)因子(BDNF)和酪氨酸激酶受體B(TrKB)陽性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)的影響，尋找針刺治療的最佳介入時(shí)機(jī)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 選用SPF級健康雄性SD大鼠，2月齡，體質(zhì)量280～300 g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號:SCXK黑2008004)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為5組:假手術(shù)組、模型組、2 h針刺組、3 d針刺組和7 d針刺組，每組各40只，各組又分為1、3、7、14 d，4 個(gè)亞組每組各10 只。

1.2 動(dòng)物模型的制備 采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大鼠局灶性永久性腦缺血模型［2］。雄性SD大鼠麻醉后仰位固定，行頸前正中縱行切口，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，游離并保護(hù)迷走神經(jīng)，在CCA近心端和遠(yuǎn)心端及ECA掛線備用，用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，然后在近心端結(jié)扎CCA、ECA。在距離CCA分叉處4 mm處剪一小切口，將栓線輕輕插入ICA，將繞在CCA遠(yuǎn)端的細(xì)線輕輕系緊，將拴線向ICA方向輕推，從ICA分叉處計(jì)算，插入深度在18 mm時(shí)，牢牢系緊CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線，縫合肌肉和皮膚。手術(shù)后大鼠出現(xiàn)右側(cè)肢體的癱瘓，提尾懸空時(shí)出現(xiàn)右側(cè)上肢的屈曲，或行進(jìn)時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈、傾斜，則提示造模成功，入選試驗(yàn)。假手術(shù)組除不栓塞大腦中動(dòng)脈外，余處理同缺血組。

1.3 針刺操作

1.3.1 2 h、3 d和7 d針刺組 動(dòng)物于造模后分別于2 h、3 d和7 d，予針刺治療。取穴:參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［3］取患肢對側(cè)百會透曲鬢穴，進(jìn)針約 0.8 mm，留針30 min，期間捻轉(zhuǎn)3次，每次1 min;雙側(cè)風(fēng)池穴、患肢的內(nèi)關(guān)穴、足三里穴，進(jìn)針約0.5 mm，留針30 min，期間行提插捻轉(zhuǎn)3次，每次1 min，1次/d。分別于1 d、3 d、7 d、14 d 隨機(jī)選取10 只大鼠，在進(jìn)行神經(jīng)功能測定后，斷頭法處死大鼠，留取檢測標(biāo)本。

1.3.2 假手術(shù)組、模型組大鼠 與針刺組相同時(shí)間不針刺，但抓取并捆綁固定，時(shí)間、條件同針刺組。

1.4 主要儀器與試劑 ATP酶測試盒(南京建成生物工程研究所);752型紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);兔抗大鼠BDNF、TrKB多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，貨號BA0565-1、BA0623;0.3 mm ×13 mm 華佗牌毫針(蘇州醫(yī)療器械廠)。

1.5 腦組織標(biāo)本采集及指標(biāo)的測定 在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，將大鼠斷頭處死，取左腦去掉嗅球、小腦及延髓，加4倍預(yù)冷的生理制備成10%的腦組織溶液，混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清液定磷，采用比色法測定ATP酶含量，計(jì)算鈉，鉀-三磷酸腺苷酶(Na+，K+－ATP 酶)、鈣，鎂-三磷酸腺苷酶(Ca2+，Mg2+－ATP 酶)的活性［4］。

每組取10只大鼠，心臟灌注，取腦，取視交叉前2 mm至視交叉后2 mm的腦組織以保證腦梗死區(qū)域包含其中，甲醛固定24 h，脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)冠狀位切片，片厚5 μm。烘干20 h，備用。用免疫組織化學(xué)法染色后，高倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，觀察計(jì)算BDNF、TrKB陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布定量數(shù)據(jù)多組間均值比較采用單因素方差分析(LSD法)。

2 結(jié)果

2.1 不同針刺治療時(shí)機(jī)對大鼠腦組織中Na+，K+－ATP酶、Ca2+和Mg2+－ATP酶活性的影響 與假手術(shù)組比較，腦梗死大鼠腦組織中Na+，K+－ATP酶和Ca2+，Mg2+－ATP酶活性下降(P＜0.01)，有先升后降的變化趨勢。不同時(shí)間點(diǎn)Na+，K+－ATP酶活性的比較:①1 d和3 d時(shí):2 h組分別與模型組、3 d組、7 d組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組、3 d組、7 d組分別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②7 d和14 d時(shí):2 h組與模型組、7 d組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);2 h與3 d組、3 d與7 d組、3 d與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);7 d組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

不同時(shí)間點(diǎn)Ca2+，Mg2+－ATP酶活性比較:①1 d和3 d時(shí):2 h組分別與模型組、3 d組、7 d組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);模型組、3 d組，7 d組分別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)②7 d時(shí):2 h組與模型組、7 d組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);2 h與3 d組、3 d與7d組、3 d組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);7 d組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。③14 d時(shí):2 h組分別與模型組、7 d組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);2 h與3 d組;3 d、7 d針刺組分別與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);3 d與7 d組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1，2。

2.2 不同針刺介入時(shí)機(jī)對腦梗死模型大鼠腦組織中BDNF、TrKB陽性細(xì)胞數(shù)的影響 假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)僅有少量表達(dá)，3個(gè)針刺組和模型組在不同時(shí)間點(diǎn)的BDNF、TrKB陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比假手術(shù)組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。模型組大鼠隨著時(shí)間的延長BDNF、TrKB陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)有增多的趨勢(P＜0.01)。

不同針刺時(shí)間點(diǎn)腦梗死大鼠BDNF、TrKB陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比較:①1 d和3 d時(shí):2 h組分別與模型組、3 d、7 d組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);模型組、3 d組、7 d組之間分別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②7 d時(shí):2 h組與模型組、7 d組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);2 h與3 d組;3 d分別與7 d組、模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);7 d組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。③14 d時(shí):2 h分別與7 d組、模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);2 h與 3 d組;3 d與 7 d組 ;3 d、7 d組分別與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表 3，4。

表1 不同針刺介入時(shí)機(jī)對各組大鼠腦組織Na+，K+－ATP酶活性的影響(±s，μmolPi/mgprot/hour，n=10)

表1 不同針刺介入時(shí)機(jī)對各組大鼠腦組織Na+，K+－ATP酶活性的影響(±s，μmolPi/mgprot/hour，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.01;與2 h針刺組比較，bP＜0.05，dP＜0.01;與模型組比較，cP＜0.05，eP＜0.01

組別5.93 ±0.63 5.69 ±0.91 5.74 ±0.83 6.01 ±0.23模型組 2.75 ±0.43ab 3.34 ±1.01ab 2.80 ±0.63ad 2.70 ±0.56ad 2 h 針刺組 3.50 ±0.61c 4.92 ±0.97c 4.88 ±0.24e 4.71 ±0.87e 3 d 針刺組 2.70 ±0.72b 3.61 ±0.81b 3.86 ±0.57bc 3.92 ±0.69bc 7 d 針刺組 2.69 ±0.56b 3.15 ±0.43b 3.17 ±0.37d 3.18 ±0.58d F值1 d 3 d 7 d 14 d假手術(shù)組2.012 1.084 6.891 2.414 P值0.005 0.002 0.000 0.000

表2 不同針刺介入時(shí)機(jī)對各組大鼠腦組織Ca2+，Mg2+－ATP酶活性的影響(±s，μmolPi/mgprot/hour，n=10)

表2 不同針刺介入時(shí)機(jī)對各組大鼠腦組織Ca2+，Mg2+－ATP酶活性的影響(±s，μmolPi/mgprot/hour，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.01;與2 h針刺組比較，bP＜0.01，dP＜0.05;與模型組比較，cP＜0.01，eP＜0.05

組別3.27 ±0.23 3.25 ±0.29 3.21 ±0.33 3.39 ±0.14模型組 1.36 ±0.36ab 2.19 ±1.01ab 1.81 ±0.47ab 1.68 ±0.53ab 2 h 針刺組 2.37 ±0.51b 3.24 ±0.71b 3.19 ±0.69c 3.21 ±0.54c 3 d 針刺組 1.35 ±0.27b 2.54 ±0.59b 2.51 ±0.38de 2.68 ±0.41de 7 d 針刺組 1.41 ±0.44b 2.23 ±0.89b 1.97 ±0.27b 2.24 ±0.93e F值1 d 3 d 7 d 14 d假手術(shù)組2.007 2.024 2.155 1.038 P值0.000 0.009 0.000 0.000

表3 不同針刺介入時(shí)機(jī)對各組大鼠BDNF陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的影響(±s，個(gè)/視野，n=10)

表3 不同針刺介入時(shí)機(jī)對各組大鼠BDNF陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的影響(±s，個(gè)/視野，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.01;與2 h針刺組比較，bP＜0.05，dP＜0.01;與模型組比較，cP＜0.05，eP＜0.01

組別2.44 ±0.23 2.41 ±0.31 2.39 ±0.47 2.47 ±0.35模型組 4.45 ±2.13ab 7.20 ±1.11ab 11.16 ±2.90ad 15.06 ±2.07ad 2 h 針刺組 6.08 ±4.16c 11.85 ±2.49c 17.78 ±3.15e 24.12 ±3.53e 3 d 針刺組 4.45 ±2.13d 7.27 ±2.11d 14.19 ±2.25bc 20.11 ±2.99bc 7 d 針刺組 4.45 ±2.13d 7.09 ±2.36d 12.02 ±2.19d 17.22 ±0.87cd F值1 d 3 d 7 d 14 d假手術(shù)組3.814 5.032 1.180 2.908 P值0.003 0.000 0.000 0.000

表4 不同針刺介入時(shí)機(jī)對各組大鼠TrKB陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的影響(±s，個(gè)/視野，n=10)

表4 不同針刺介入時(shí)機(jī)對各組大鼠TrKB陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的影響(±s，個(gè)/視野，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.01;與2 h針刺組比較，bP＜0.05，dP＜0.01;與模型組比較，cP＜0.05，eP＜0.01

組別2.73 ±0.23 2.69 ±0.28 2.77 ±0.37 2.80 ±0.45模型組 4.95 ±1.73ab 10.30 ±1.11ab 12.75 ±2.10ad 19.43 ±1.67ad 2 h 針刺組 7.57 ±1.08c 20.25 ±4.09c 22.98 ±3.36e 29.03 ±4.22e 3 d 針刺組 4.88 ±0.78d 10.99 ±1.28d 17.17 ±3.25bc 23.39 ±3.35bc 7 d 針刺組 5.07 ±0.8d 11.01 ±1.02d 12.99 ±2.33d 17.19 ±2.16cd F值1 d 3 d 7 d 14 d假手術(shù)組2.565 13.577 2.560 6.385 P值0.001 0.000 0.000 0.000

3 討論

針刺能夠有效改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能，已經(jīng)在臨床中得到了有效的證實(shí)。本研究中作者根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合中醫(yī)傳統(tǒng)理論，頭部腧穴選取百會透曲鬢，這種取穴方法在頭部橫跨頂、額、顳3區(qū)，并有督脈、膀胱經(jīng)、膽經(jīng)3條陽經(jīng)貫穿，具有統(tǒng)調(diào)一身之陽氣、醒腦開竅的功能，并能鼓動(dòng)頭部經(jīng)氣的運(yùn)行，通達(dá)全身經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)。從解剖學(xué)和電生理角度來看，針刺產(chǎn)生的生物電效應(yīng)傳送到大腦的運(yùn)動(dòng)區(qū)和感覺區(qū)的皮質(zhì)，提高缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的興奮性，改善皮層的腦血液循環(huán)，腦代償功能加強(qiáng)，功能得到改善［5-6］。對癥選取癱瘓肢體的內(nèi)關(guān)穴和足三里穴可促進(jìn)癱瘓肢體肌力的提高，改善患肢功能。

腦梗死后，首先發(fā)生的是腦血流量的減少和能量衰竭，能量耗竭是缺血后細(xì)胞損傷的始動(dòng)因素［7］。ATP酶是一種蛋白酶，其活性改變是缺血后神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性損傷的重要環(huán)節(jié)，Na+－K+－AT酶和Ca2+，Mg2+－ATP酶是依賴ATP直接供能的酶，它們的活性增強(qiáng)表明ATP酶增多，能量代謝的增強(qiáng)，活性減低表明能量代謝能力下降。因此，把ATP酶的活力作為能量代謝檢測的主要指標(biāo)。

BDNF廣泛分布于大腦中，在維持神經(jīng)細(xì)胞功能、防止神經(jīng)細(xì)胞退行性改變以及修復(fù)再生等多方面發(fā)揮著重要的作用，是大腦中含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子;研究表明，BDNF參與腦缺血性損傷的保護(hù)過程［8］，可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，抵抗缺血性損傷，保護(hù)缺血半暗帶的神經(jīng)細(xì)胞，減少梗死面積，抑制遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞的壞死。TrKB是BDNF的高親受體，當(dāng)BDNF與其相結(jié)合后，形成的二聚體同時(shí)完成自身磷酸化，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，促神經(jīng)細(xì)胞的存活、修復(fù)再生，對腦缺血損傷的神經(jīng)細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。

本研究在大鼠腦缺血后2 h、3 d、7 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別開始針刺，分4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)觀察對缺血腦組織能量代謝的影響。腦梗死后，缺血腦組織ATP酶受到抑制，生成減少，大鼠腦組織的Na+，K+－ATP酶，Ca2+，Mg2+－ATP酶活性急劇下降，1 d時(shí)最低，隨著時(shí)間的延長出現(xiàn)先升在降的變化趨勢，這可能與腦缺血損傷機(jī)制的復(fù)雜化有關(guān)。2 h針刺組、3 d針刺組、7 d針刺的ATP酶活性在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)較模型組均有不同程度的升高，且2 h組高于3 d組和7 d組，提示針刺可顯著改善缺血腦組織的能量代謝，恢復(fù) Na+，K+－ATP酶、Ca2+，Mg2+－ATP酶的活性，發(fā)揮腦保護(hù)的作用，而且早期介入針刺的效果更好。

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