高脂飲食C57BL／6J小鼠Ym-1蛋白表達(dá)與胰島素抵抗的關(guān)系

李春燕，李素梅，王維，方星星，趙娜

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230001；2.安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室）

高脂飲食C57BL／6J小鼠Ym-1蛋白表達(dá)與胰島素抵抗的關(guān)系

李春燕1，李素梅1，王維2，方星星1，趙娜1

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230001；2.安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室）

目的探討巨噬細(xì)胞選擇性活化與肥胖相關(guān)性胰島素抵抗間的關(guān)系。方法28只3周齡雄性C57BL／6J小鼠，隨機(jī)平均分為2組：普食組（A組，n＝14只），高脂飲食組（B組，n＝14只），分別給予標(biāo)準(zhǔn)飼料與高脂飼料喂養(yǎng)。6周、12周分別檢測空腹血糖（（FBG）、血漿胰島素（FIns）水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），測定肝組織勻漿三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平；HE染色觀察肝臟及脂肪組織病理學(xué)改變，DAB染色及免疫熒光染色檢測小鼠肝臟、脂肪組織M2型巨噬細(xì)胞的特異性蛋白Ym-1表達(dá)情況。結(jié)果第6周B組小鼠體質(zhì)量、FIns、HOMA-IR、TC均明顯高于A組，F(xiàn)BG、TG、ALT較A組升高不明顯；第12周B組小鼠體質(zhì)量、FBG、FIns、HOMA-IR、TC、TG和ALT進(jìn)一步升高，均明顯高于A組。第12周B組小鼠脂肪組織內(nèi)巨噬細(xì)胞選擇性活化標(biāo)志Ym-1蛋白表達(dá)較A組增強(qiáng)。結(jié)論巨噬細(xì)胞選擇性活化可能參與了肥胖誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。

胰島素抗體；巨噬細(xì)胞活化；膳食，高脂；模型，動物

巨噬細(xì)胞在炎癥和組織修復(fù)過程中具有重要作用，脂肪組織慢性炎性與肥胖、胰島素抵抗及2型糖尿病關(guān)系十分密切，大量巨噬細(xì)胞的浸潤是脂肪組織慢性炎癥重要特征［1］。巨噬細(xì)胞可被多種刺激因子激活，主要分為M1型和M2型兩大類［2-3］。

研究表明，肥胖相關(guān)的胰島素抵抗與巨噬細(xì)胞的活化有著密切關(guān)系［4］。鑒于目前巨噬細(xì)胞亞型與胰島素敏感性的研究報道較少，本文通過M2型巨噬細(xì)胞特異性Ym-1蛋白的表達(dá)擬探討食源性肥胖小鼠體內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞與胰島素抵抗間的關(guān)系的研究。

1 材料和方法

1.1 小鼠模型制備及取材

1.1.1 模型制備 3周齡雄性C57BL／6J小鼠28只，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，平均體質(zhì)量（13.6±2.6）g。普食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，每組14只。其中A組：普食組，B組：高脂飲食組。稱體質(zhì)量、剪尾測血糖記錄作為基礎(chǔ)指標(biāo)。SPF清潔級飼養(yǎng)，每3天換飼料和飲用水1次，每周稱體質(zhì)量記錄之。高脂飼料由67.7%基礎(chǔ)飼料，20%蔗糖，10%熟豬油，2%膽固醇，0.3%三號膽鹽加工成。

1.1.2 標(biāo)本收集 造模6周和12周末，各組隨機(jī)選取C57BL／6J小鼠7只，隔夜禁食，稱量體質(zhì)量，剪尾血糖儀測空腹血糖（FBG），分別予以10%的水合氯0.0035 mL／kg腹腔注射麻醉小鼠，眼球摘除收集血清、固定小鼠、打開腹腔取腹部脂肪、肝組織，部分組織置4%多聚甲醛溶液固定，其余組織放凍存管中液氮保存、待用。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 KY-190型全自動生化分析儀（南京特康生化分析儀器有限公司），紫外分光光度儀（美國哈希公司），DFM-96型10管放射免疫γ計數(shù)儀（安徽合肥眾成機(jī)電公司）。

1.2.2 試劑 兔抗小鼠Ym-1一抗（加拿大STEMCELL公司），TC、TG測定試劑盒（長春匯力公司），ALT測定試劑盒（南京建成公司），胰島素放免測定試劑盒（北京北方研究所），SP法免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋公司），山羊抗兔IgG FITC標(biāo)記二抗（北京中杉金橋公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測定

1.3.1 血清胰島素水平測定 血清胰島素水平測定采用放射免疫法測定，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 TC、TG及ALT測定 紫外分光光度計測定TC、TG，全自動生化分析儀測定ALT。

1.3.3 肝臟、脂肪組織巨噬細(xì)胞Ym-1的表達(dá) 小鼠新鮮肝臟及脂肪組織置4%多聚甲醛溶液中固定48h，石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片（片厚4μm）。DAB染色步驟及免疫熒光染色步驟均按試劑盒說明書操作，每張切片平均彩圖5幅，圖像分析處理采用image-pro plus 6.0軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間數(shù)據(jù)的顯著性比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)指標(biāo)采用pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對小鼠體質(zhì)量的影響 見表1。

表1 各組C57BL／6J小鼠體質(zhì)量變化（±s，g）

表1 各組C57BL／6J小鼠體質(zhì)量變化（±s，g）

注：與普食組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別鼠數(shù)（只）0周6周12周普食組14 12.38±1.27 24.27±0.82 28.33±1.78高脂飲食組14 12.82±0.85 26.38±1.24a32.5±1.09b

2.2 高脂飲食對小鼠FBG、FIns、HOMA-IR水平的影響 見表2。

2.3 高脂飲食對小鼠TC、TG、ALT水平的影響見表3。

表2 各組C57BL／6J小鼠血清指標(biāo)比較（±s，n＝7）

表2 各組C57BL／6J小鼠血清指標(biāo)比較（±s，n＝7）

注：與普食組比較，aP＜0.01，bP＜0.05

組別FBG（mmol／L）FIns（IU／L）6周12周6周12周HOMA-IR 6周12周普食組8.97±2.90 8.30±1.50 9.0±2.49 10.31±2.62 0.43±0.21 0.34±0.13高脂飲食組8.47±0.25 10.12±1.04a30.98±16.5a46.16±10.18a6.79±2.38b17.5±6.16a

表3 C57BL／6J小鼠肝勻漿生化指標(biāo)比較（±s，n＝7）

表3 C57BL／6J小鼠肝勻漿生化指標(biāo)比較（±s，n＝7）

注：與普食組比較，aP＜0.01

組別TC（mmol／L）TG（mmol／L）ALT（mmol／L）6周12周6周12周6周12周普食組2.39±0.13 2.64±0.64 1.36±0.66 1.47±0.18 23.12±4.21 24.56±7.82高脂飲食組3.92±0.20a4.41±0.59a1.42±0.54 1.92±0.17a30.56±6.67 60.27±10.06a

表4 兩組小鼠12周脂肪組織M2型巨噬細(xì)胞Ym-1蛋白表達(dá)情況（±s）

表4 兩組小鼠12周脂肪組織M2型巨噬細(xì)胞Ym-1蛋白表達(dá)情況（±s）

注：與普食組比較，aP＜0.01

組別鼠數(shù)（只）巨噬細(xì)胞／脂肪細(xì)胞DAB染色I(xiàn)OD免疫熒光IOD普食組7 0.434±0.071 10 359.15±1 655.91 4 864.13±179.15高脂飲食組7 0.791±0.053a16 345.15±2 399.58a12 776.4±3 550.89a

2.4 肝組織及脂肪組織Ym-1蛋白表達(dá) 分組喂養(yǎng)6周、12周，A組、B組肝組織DAB染色及免疫熒光染色均未見M2型巨噬細(xì)胞特異性Ym-1蛋白的表達(dá)。高脂喂養(yǎng)第6周，B組小鼠腹部大網(wǎng)膜未見明顯脂肪組織，高脂喂養(yǎng)第12周可見腹部大網(wǎng)膜脂肪組織，DAB染色及免疫熒光染色結(jié)果均表明A組脂肪組織可見少量M2型巨噬細(xì)胞特異性Ym-1蛋白表達(dá)，各組單個視野下（×400，每組計5個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析）M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)情況，見圖1，表4。

2.5 脂肪組織Ym-1蛋白的表達(dá)分別與FBG、FIns、HOMA-IR相關(guān)分析 見表5。

表5 Ym-1蛋白分別與FBG、FIns、HOMA-IR的相關(guān)分析

3 討論

動物模型研究顯示在正常脂肪組織中巨噬細(xì)胞以M2型為主，高表達(dá)IL-10，肥胖過程中，聚集于壞死脂肪組織周圍的巨噬細(xì)胞以M1型為主，高表達(dá)TNF-α、IL-6、iNOS等M1標(biāo)志，上述因子可造成胰島素抵抗，同時肥胖過程中定植于脂肪組織的巨噬細(xì)胞多表達(dá)M2型有關(guān)的基因產(chǎn)物［5-9］，并進(jìn)一步證明IL-10可增加脂肪細(xì)胞的糖攝取并抑制細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的胰島素抵抗［10-11］。在正常飲食大鼠中敲除巨噬細(xì)胞PPAR-γ基因，導(dǎo)致M2巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，功能受損，胰島素敏感性降低［12］，以上研究證實(shí)M2巨噬細(xì)胞可改善飲食相關(guān)性胰島素抵抗。

作為M2型巨噬細(xì)胞特征性的標(biāo)志物之一的Ym-1蛋白是一種新的嗜酸粒細(xì)胞趨化因子，它可破壞多種寄生蟲（包括幼蟲）結(jié)構(gòu)成分殼多糖等，從而抵抗蟲體入侵［13］，巨噬細(xì)胞中的Ym-1基因可升高IL-10水平促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的抗炎作用［14］。本文肝臟組織DAB染色及疫熒光結(jié)果均未見明顯的M2型巨噬細(xì)胞浸潤，表明肝臟組織中浸潤可能有其他類型的炎性細(xì)胞，但肥胖組脂肪組織中M2型巨噬細(xì)胞特異性Ym-1蛋白表達(dá)較正常組增強(qiáng)，表明肥胖過程中脂肪組織中M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，與Fujisaka［2］的研究結(jié)果一致。另外Prieur等［4］研究表明肥胖初期脂肪組織中以M2型巨噬細(xì)胞為主，隨著肥胖的發(fā)生發(fā)展脂肪組織中巨噬細(xì)胞逐漸向M1極化同時伴隨著重度肥胖及胰島素抵抗。

本研究中C57BL／6J小鼠大網(wǎng)膜脂肪組織Ym-1蛋白表達(dá)與FBG、FIns、HOMA-IR呈正相關(guān)分析，可能與肥胖過程中，M1型巨噬細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞比例失調(diào)，M1型巨噬細(xì)胞降低胰島素敏感性的效應(yīng)遠(yuǎn)大于M2型巨噬細(xì)胞改善胰島素抵抗的效應(yīng)有關(guān)，與Fujisaka等［2］研究一致。

鑒于M2型巨噬細(xì)胞在脂肪組織中表達(dá)，且肥胖、脂肪炎癥和胰島素抵抗三者之間關(guān)系密切，推測M2型巨噬細(xì)胞可能是抑制肥胖小鼠及胰島素抵抗的重要因素。特異性影響巨噬細(xì)胞的極化，或可為干預(yù)肥胖相關(guān)的胰島素抵抗及2型糖尿病奠定理論基礎(chǔ)，但目前M2型巨噬細(xì)胞與肥胖相關(guān)的胰島素抵抗研究尚處于探索階段，許多問題尚待闡明。

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The correlation of the expression of Ym-1 in adipose tissue in high-fat diet-fed C57BL／6Jm ice and insulin

resistance

LIChunyan*，LISumei，WANGWei，F(xiàn)ANG Xingxing，ZHAO Na（*Department of Endocrinology，Anhui

Provincial Hospital，Hefei230001，China）

LISumei，Email：lisumei＠m(xù)edmail.com.cn

ObjectiveTo explore the relationship between the selective activation ofmacrophages and insulin resistance.Methods 28 male C57BL／6Jmice were randomly assigned into 2 groups.the standard chow group （group A，n＝14），micewere fed with basic diet，and high-fat diet-fed group（group B，n＝14），mice were t fed with high-fat diet.At6 and 12 weeks，the levels of fasting peripheral blood glucose（FBG），fasting plasma insulin（FIns）were detected and the levels of triglyceride（TG），cholesterol（TC）and glutamic pyruvic transaminase（ALT）were alsomeasured.The changes in adipose tissue and liver were observed.The expression of Ym-1proteinin was detected.ResultsCompared with group A，the bodymass，the level of FIns，HOMA-IR，and TC in group B were significantly increased at the 6th week.However，there were no statistically differences in the levels of FBG，TG and ALT.The body mass，the levels of FBG，F(xiàn)Ins，HOMA-IR，TC，TG and ALT in group B were significantly higher than those in the group A at the 12th week.The expression ofmacrophages specificmarker Ym-1 in adipose tissuewas significantly increased in group B at the 12th week compared with that in group A.ConclusionSelective activation ofmacrophage may play a role in the development of obesity-related insulin resistance.

Insulin antibodies；Macrophage activation；Diet，high-fat；Models，Animal

R392

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.04.017

2014-01-05）

安徽省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（13zc017）

李春燕，醫(yī)師，Email：ahtclcy＠163.com

李素梅，主任醫(yī)師，Email：lisumei＠m(xù)edmail.com.cn