日本血吸蟲四跨膜孤兒受體（TOR）克隆及其第一個(gè)膜外區(qū)基因的表達(dá)

馬 帥，韓艷輝，洪 煬，張 旻，曹曉丹，韓 倩，劉艷濤，陸 看，馬茜茜，陸 珂，賈秉光，林矯矯,2，傅志強(qiáng)

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

日本血吸蟲四跨膜孤兒受體（TOR）克隆及其第一個(gè)膜外區(qū)基因的表達(dá)

馬 帥1，韓艷輝1，洪 煬1，張 旻1，曹曉丹1，韓 倩1，劉艷濤1，陸 看1，馬茜茜1，陸 珂1，賈秉光1，林矯矯1,2，傅志強(qiáng)1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

埃及血吸蟲和曼氏血吸蟲四跨膜孤兒受體（trispanning orphan receptors, TOR）受體可以結(jié)合補(bǔ)體C2a，可能在血吸蟲免疫逃避過程中起重要作用。為研究日本血吸蟲TOR受體的特性和功能，利用PCR擴(kuò)增到SjTOR基因并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；同時(shí)克隆了SjTOR基因N端第一個(gè)膜外區(qū)（ed1）基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-SjTOR-ed1，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)后用組蛋白親和層析純化獲得重組蛋白SjTOR-ed1，Western blot結(jié)果顯示rSjTOR-ed1能被日本血吸蟲陽性小鼠血清識(shí)別。該研究為進(jìn)一步開展研究日本血吸蟲TOR受體的功能提供了基礎(chǔ)。

日本血吸蟲；四跨膜孤兒受體；生物信息學(xué)；基因克??；Western blot

血吸蟲?。╯chistosomiasis）是由血吸蟲尾蚴感染人或哺乳動(dòng)物而引起的一種慢性消耗性人畜共患寄生蟲病，在包括亞州、非州、拉丁美洲等的76個(gè)國家或地區(qū)流行，我國南方地區(qū)流行的是日本血吸蟲病，嚴(yán)重危害社會(huì)、經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。對(duì)受感染的人和家畜采用吡喹酮進(jìn)行藥物治療是血吸蟲病防控中控制傳染源常用的技術(shù)手段，然而藥物治療并不能預(yù)防或阻止該病的再感染[2]。因此通過研發(fā)抗血吸蟲疫苗，利用其免疫預(yù)防的長期效果輔助藥物治療的完全有效但短期的作用，是血吸蟲防治技術(shù)的重要研究方向。

血吸蟲尾蚴鉆過終末宿主的皮膚，經(jīng)歷復(fù)雜的移行過程發(fā)育為成蟲在哺乳動(dòng)物的下腔靜脈系中長期寄生。血吸蟲在宿主體內(nèi)的發(fā)育及其長期寄生生活和其強(qiáng)大的逃避宿主免疫攻擊的能力是密切相關(guān)的。血吸蟲體被與宿主直接接觸，其相關(guān)物質(zhì)可能在免疫逃避中起重要作用[3]。因此，分離鑒定這些和免疫逃避相關(guān)的分子，研究其功能對(duì)了解血吸蟲免疫逃避機(jī)理及疫苗研究有重要幫助。

血吸蟲四跨膜孤兒受體（trispanning orphan receptors, TOR）蛋白是一種血吸蟲體被表面抗原受體[4]，在埃及、曼氏血吸蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，其作為表面受體可以結(jié)合補(bǔ)體C2a，由此推測(cè)其可能通過抑制補(bǔ)體激活途徑，而在血吸蟲免疫逃避過程中起重要作用。日本血吸蟲TOR蛋白的研究未見報(bào)道。劉峰等[5]在對(duì)不同發(fā)育時(shí)期日本血吸蟲體被表膜蛋白進(jìn)行蛋白組學(xué)分析時(shí)，在多個(gè)時(shí)期分離到了TOR蛋白，本實(shí)驗(yàn)室在前期的日本血吸蟲體被表膜蛋白質(zhì)組研究中也曾分離鑒定到TOR蛋白。本研究克隆了日本血吸蟲TOR基因，表達(dá)了其主要功能區(qū)—N端第一個(gè)膜外區(qū)（ed1）基因，用Western blot檢測(cè)了重組蛋白（rSjTOR-ed1）的抗原性，為深入研究SjTOR的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Trizol和superscripTMII反轉(zhuǎn)錄酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；ExTaqHot Start DNA聚合酶、小量質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒pMD19-T、限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoR I、T4 DNA連接酶等購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司；QIAquick Gel Extraction Kit購自Qiagen公司；Agarose、DEPC等購自上海生工生物工程公司；DNA Marker DM2000、DM5000購自上海天根生物科技有限公司；硝酸纖維素膜（Whatman）購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；Bacto-yeast extract、Bacto-trypton為Oxoid 公司產(chǎn)品；Ni-NTA His. Bind Resin（Merck-Novagen）購自中科新生命生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）購自上海鼎國生物工程公司；DAB顯色試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 菌種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和血清 原核表達(dá)載體pET-28a (+)由上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)大腸桿菌（E.coli）DH5α、BL21（DE3）購自天根生化科技（北京）有限公司；日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；新西蘭白兔（雄性，2.5～3.0 kg）購自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)；6周齡雄性（SPF級(jí)）BALB/c小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；將新西蘭白兔以腹部貼片法感染尾蚴2000條，感染42 d后剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體，用PBS充分洗滌去除粘附的宿主組織后，凍存于液氮備用。日本血吸蟲42 d陽性血清是將小鼠感染42 d后眼球采血獲得。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄PCR 取保存在液氮中的42 d日本血吸蟲蟲體，按Trizol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取及純化，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，產(chǎn)物保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SjTOR基因擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析 根據(jù)日本血吸蟲四跨膜孤兒受體基因（GI:56756944）序列，利用Primer Premier 5.0軟件分析并設(shè)計(jì)引物，并以1.2.1制備的日本血吸蟲42 d成蟲cDNA為模板，擴(kuò)增SjTOR ORF的DNA片段。上下游引物分別：5'-GCGGAATTCATGCCACGAGCTTCT-3'，5'-CGCCTCGAGTTAGCAAGGATGAAC-3'（下劃線部分分別表示EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)），引物由上海華津生物技術(shù)有限公司合成。PCR程序：94℃預(yù)變性5 min，熱循環(huán)參數(shù)為94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃終延伸1 min共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸15 min，10℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，再克隆至載體pMD19-T中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，挑選單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送上海華津生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

將測(cè)序得到的DNA序列用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)；用Clustal X軟件對(duì)其相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)；利用DNAStar對(duì)其氨基酸組成、序列、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用SignalP 4.0預(yù)測(cè)分析其信號(hào)肽信息；利用NetNGlyc 1.0（www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc）預(yù)測(cè)分析肽段的糖基化位點(diǎn)；利用GOR IV（http://gor.bb.iastate.edu/）和PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）程序預(yù)測(cè)分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.3 SjTOR-ed1片段擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET-28a-SjTOR-ed1的構(gòu)建 根據(jù)1.2.2的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果和曼氏血吸蟲四跨膜孤兒受體SmTOR的跨膜分析結(jié)果，SjTOR的N端第47～168位可能為第一個(gè)膜外區(qū)SjTOR-ed1，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并以日本血吸蟲42 d成蟲cDNA為模板，擴(kuò)增與SjTOR-ed1肽段相對(duì)應(yīng)的DNA片段。上下游引物分別：5'-GCGGAATTCATGACGTTTAATCCG-3'，5'-CGCCTCGAGTCAAATGTATG GACT-3'（下劃線部分分別表示EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)），引物由上海華津生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件與1.2.2中所述相似。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收后，用EcoR I和XhoI雙酶切克隆至表達(dá)載體pET-28a(+)中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SjTOR-ed1，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒送上海華津生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒純化后保存于－20℃。

1.2.4 重組蛋白rSjTOR-ed1在大腸桿菌中的表達(dá)及純化 將純化的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SjTOR-ed1轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，以PCR鑒定為陽性的克?。╬ET-28a-SjTOR-ed1/BL21）接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600=1.0時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)后的不同時(shí)間點(diǎn)分別收集菌液，以SDS-PAGE電泳分析經(jīng)超聲裂解后的菌體蛋白，判斷重組蛋白的表達(dá)狀況，確定相關(guān)誘導(dǎo)表達(dá)條件及最佳誘導(dǎo)時(shí)間。用8 mol/L尿素溶解以包涵體形式存在的重組蛋白，利用Ni-NTA His、Bind Resin層析柱進(jìn)行分離純化，隨后以含6、4、2.1 mol/L尿素的PBS及PBS逐步透析復(fù)性。

1.2.5 重組蛋白rSjTOR-ed1的抗原性分析 將2 μg復(fù)性的重組蛋白進(jìn)行Western blot分析其抗原性，具體將rSjTOR-ed1進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，經(jīng)低溫電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜上，用42 d小鼠日本血吸蟲陽性血清作一抗室溫溫育1 h，正常小鼠血清作陰性對(duì)照，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）為二抗室溫溫育2 h，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進(jìn)行顯色，水洗終止反應(yīng)，觀察有無特異性條帶出現(xiàn)并拍照保存結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SjTOR、SjTOR-ed1片段擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET-28a-SjTOR-ed1的構(gòu)建以日本血吸蟲42 d cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到大小依次為1245、357 bp的DNA片段（圖1A），與預(yù)期大小相符。將該片段純化回收，利用EcoR I和XhoI限制性內(nèi)切酶克隆入載體pET-28a (+)，構(gòu)建pET-28a-SjTOR-ed1重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)過酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)重組準(zhǔn)確（圖1B）。

2.2 SjTOR基因生物信息學(xué)分析分析結(jié)果顯示，SjTOR基因編碼414個(gè)氨基酸殘基，其中強(qiáng)堿性氨基酸31個(gè)、強(qiáng)酸性氨基酸30個(gè)、疏水性氨基酸142個(gè)、極性氨基酸146個(gè)，理論分子量為46479.17 Da，理論等電點(diǎn)為7.59。與參考序列（Q5DC12）相比有一個(gè)氨基酸差異（第130位氨基酸，由K突變?yōu)镋）。SjTOR與SmTOR（C4QM85）、ShTOR（Q9BLM6）及TcCRIT（Q5J7P3）的氨基酸相似性分別為77.0%、72.0%、75.0%（圖2）。SignalP預(yù)測(cè)未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，NetNGlyc分析顯示該序列可能有5個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于第305、362、372、377、393位氨基酸。氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，該多肽以α螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主（圖3），含有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，與SmTOR、ShCTIR相似，比ShTOR多一個(gè)跨膜結(jié)果（圖2）。

圖1 SjTOR基因克隆和SjTOR-ed1片段克隆及其重組質(zhì)粒鑒定Fig.1 Cloning of SjTOR gene and SjTOR-ed1 fragment (A) and identif cation of the recombinant plasmid pET-28a-SjTOR-ed1 by EcoR I and Xho I digestion (B)

圖2 TOR基因氨基酸序列的同源性分析Fig.2 Clustal X alignment of the amino acid sequences of TOR

圖3 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of the secondary structure of SjTOR protein

2.3 重組蛋白rSjTOR-ed1在大腸桿菌中的表達(dá)及純化將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SjTOR-ed1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在14.5 kDa處可見特異的重組蛋白分子，并且誘導(dǎo)時(shí)間與該蛋白的表達(dá)量呈正比，誘導(dǎo)5 h后表達(dá)量較高（圖4）?；厥站w蛋白進(jìn)行溶解試驗(yàn)，結(jié)果表明重組蛋白以包涵體形式存在，但可溶解于8 mol/L尿素溶液中。在變性條件下經(jīng)過Ni-NTA His·Bind Resin 樹脂純化后，可以獲得較純的重組蛋白（圖5）。而后將純化的重組蛋白用含不同濃度梯度尿素/PBS溶液透析復(fù)性，最后用PBS透析，可得到復(fù)性的重組蛋白rSjTOR-ed1。

圖4 SDS-PAGE分析重組蛋白rSjTOR-ed1時(shí)相表達(dá)量Fig.4 SDS-PAGE analysis of rSjTOR-ed1 protein at different expression time points

圖5 SDS-PAGE分析純化的重組蛋白rSjTOR-ed1Fig.5 SDS-PAGE analysis of purif ed rSjTOR-ed1

2.4 重組蛋白rSjTOR-ed1的抗原性分析應(yīng)用重組蛋白rSjTOR-ed1進(jìn)行的Western blot分析結(jié)果顯示，小鼠陰性血清不能識(shí)別，可以被小鼠日本血吸蟲陽性血清識(shí)別（圖6），表明其具有良好的抗原性。

圖6 重組蛋白rSjTOR-ed1的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of recombinant rSjTOR-ed1 protein

3 討論

血吸蟲尾蚴突破皮膚屏障后即可受到宿主免疫應(yīng)答的攻擊，補(bǔ)體反應(yīng)是宿主最早開始?xì)x體的免疫應(yīng)答[6,7]。但是血吸蟲在長期的進(jìn)化過程中也積累了應(yīng)對(duì)宿主補(bǔ)體系統(tǒng)的能力，血吸蟲在尾蚴階段對(duì)血清補(bǔ)體是非常敏感的，但在尾蚴轉(zhuǎn)變?yōu)橥x2～4 h后對(duì)血清補(bǔ)體殺傷的敏感性就開始逐漸下降[8]，這表明血吸蟲在感染早期就對(duì)宿主的補(bǔ)體反應(yīng)有抑制或調(diào)節(jié)作用，這種轉(zhuǎn)變可能和血吸蟲膜結(jié)構(gòu)變化和體被表膜上的分子有關(guān)[9,10]。

TOR分子，又稱CRIT（complement C2 receptor inhibitor trispanning），首先在埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲中鑒定得到[4]，后發(fā)現(xiàn)廣泛分布在包括從早期的硬骨鱈魚到大鼠和人類多種生物[11]。對(duì)人CRIT分子的特性和功能研究表明，CRIT分子和C4b分子具有相似的補(bǔ)體C2結(jié)合位點(diǎn)，可與C2補(bǔ)體結(jié)合阻止C3轉(zhuǎn)化酶形成，從而阻斷補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11-14]。Hui等[15]研究發(fā)現(xiàn)CRIT也可通過其ed1的一段多肽CRIT-H17阻斷D因子介導(dǎo)的B因子的裂解從而干擾補(bǔ)體替代途徑的激活。關(guān)于血吸蟲TOR分子的研究報(bào)道僅見于埃及血吸蟲和曼氏血吸蟲，對(duì)日本血吸蟲TOR分子的研究尚未展開。本研究克隆了SjTOR基因全長序列并進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示該序列不含有信號(hào)肽且與SmTOR相似性最高，都具有4個(gè)跨膜區(qū)，其中第一個(gè)膜外區(qū)ed1含有和C4b相似的保守位點(diǎn)[16]。因此，推測(cè)SjTOR分子可能具有抑制和調(diào)節(jié)宿主補(bǔ)體反應(yīng)的功能，并在移行發(fā)育過程中發(fā)揮重要的免疫逃避功能。

Lochmatter等[17]應(yīng)用重組SmTOR-ed1在兩次獨(dú)立的小鼠曼氏血吸蟲病免疫保護(hù)試驗(yàn)中分別誘導(dǎo)了64%和45%的減蟲率，結(jié)果表明SmTOR-ed1重組蛋白是一個(gè)有潛力的血吸蟲疫苗候選抗原分子。本文首次克隆了日本血吸蟲TOR基因，分析發(fā)現(xiàn)其具有保守的補(bǔ)體分子C2結(jié)合位點(diǎn)，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)純化獲得的重組蛋白rSjTOR-ed1具有較好的抗原性。該結(jié)果為后續(xù)評(píng)估其作為候選疫苗分子潛力、開展其表達(dá)特性及生物學(xué)功能研究提供了基礎(chǔ)。

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CLONING OF TRISPANNING ORPHAN RECEPTOR OF SCHISTOSOMA JAPONICUM AND EXPRESSION OF ITS FIRST EXTRACELLUAR DOMAIN

MA Shuai, HAN Yan-hui, HONG Yang, ZHANG Min, CAO Xiao-dan, HAN Qian, LIU Yan-tao, LU Kan, MA Qian-qian, LU Ke, JIA Bing-guang, LIN Jiao-jiao, FU Zhi-qiang
(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

Trispanning orphan receptors ofSchistosoma haematobium(ShTOR) andS. mansoni(SmTOR) can bind to complement C2a, which may play an important role in immune evasion ofSchistosoma.To characterize functions ofSchistosoma japonicumtetraspanning orphan receptor (SjTOR), entire SjTOR ORF was amplified in PCR and its sequence was analyzed in bioinformatics. Moreover, the N-terminal extracellular domain 1 (ed1) of the SjTOR gene was subcloned into vector pET-28a (+) to construct a recombinant plasmid pET-28a-SjTOR-ed1. The recombinant rSjTOR-ed1 was expressed inEscherichiacoli BL21 (DE3) and purif ed using a Ni-NTA His·Bind Resin. Western blot analysis showed that rSjTOR-ed1 reacted with schisosomasis-positive mouse serum. The results from the present study were useful to characterize functions of SjTOR in future study.

Schistosoma japonicum;trispanning orphan receptor; bioinformatics; cloning; Western blot

S852.735

A

1674-6422（2014）06-0046-07

2014-08-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31472188）; 上海市科技發(fā)展基金(12140902700)

馬帥，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

傅志強(qiáng)， E-mail：fuzhiqiang@shvri.ac.cn