紫草素抑制人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞增殖及其機(jī)制的研究

唐旭霞 葉再元

紫草素抑制人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞增殖及其機(jī)制的研究

唐旭霞 葉再元

目的 了解紫草素抑制甲狀腺癌TT細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制。方法采用MTT法分析紫草素對(duì)人甲狀腺癌TT細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析紫草素對(duì)TT細(xì)胞周期分布和凋亡的影響；透射電鏡觀察紫草素對(duì)TT細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)控。結(jié)果不同濃度紫草素作用24～72h對(duì)TT細(xì)胞均有抑制增殖的作用，并隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。紫草素作用24h，2、4μg/ml紫草素組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡峰（亞二倍體峰），與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但未見(jiàn)明顯的細(xì)胞周期阻滯。AnnexinV-PE/7-AAD雙染法分析細(xì)胞凋亡，2μg/ml紫草素作用TT細(xì)胞24h，早期凋亡細(xì)胞增至8.0%；而空白對(duì)照組為0.2%，凋亡后期繼發(fā)壞死細(xì)胞為11.3%，空白對(duì)照組為0.1%；作用48h后，早期凋亡細(xì)胞為24.9%，凋亡后期繼發(fā)壞死細(xì)胞上升為14.2%。2μg/ml紫草素作用TT細(xì)胞24h，透射電鏡觀察可見(jiàn)典型的細(xì)胞凋亡和自噬結(jié)構(gòu)。結(jié)論紫草素具有抑制人甲狀腺癌TT細(xì)胞增殖的作用，呈劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系；其作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬有關(guān)。

紫草素 甲狀腺髓樣癌 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡

甲狀腺髓樣癌（medullary carcinoma of thyroid，MTC）來(lái)源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞（又稱(chēng)C細(xì)胞），約占全部甲狀腺惡性腫瘤的5%～10%[1]。MTC屬中度惡性腫瘤，女性發(fā)病率略多于男性。目前手術(shù)切除仍是其首選根治方式，與分化型甲狀腺癌不同，131I對(duì)MTC無(wú)治療作用，放療、放射性核素治療及化療等效果均不佳[2-3]。積極尋找MTC新的治療靶點(diǎn)及對(duì)治療有效的藥物具有重大意義。紫草為紫草科多年生草本植物新疆紫草干燥根，在我國(guó)有悠久的藥用歷史，目前研究表明，紫草素具有抗腫瘤作用[4-7]。本研究旨在探討紫草素對(duì)MTC TT細(xì)胞是否有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞株系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，紫草素購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TT細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 TT細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下，將TT細(xì)胞培養(yǎng)在F-12K培養(yǎng)液中。吸干培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入0.05%胰蛋白酶工作液1ml快速前后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶4～5次以便胰蛋白酶包被所有瓶?jī)?nèi)細(xì)胞，吸出胰蛋白酶工作液，另加入0.05%胰蛋白酶工作液1ml，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶4～5次。細(xì)胞脫落前吸出胰蛋白酶工作液。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋松松擰上后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中2～5min。用手輕拍培養(yǎng)瓶，檢查細(xì)胞脫壁情況，若無(wú)細(xì)胞脫落將細(xì)胞培養(yǎng)瓶再放回37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育數(shù)分鐘，繼續(xù)輕拍細(xì)胞培養(yǎng)瓶直至細(xì)胞完全脫落，再懸細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)（4ml），輕輕吹打細(xì)胞使得團(tuán)狀細(xì)胞分散，以所需細(xì)胞密度接種細(xì)胞。

1.2.2 TT細(xì)胞增殖影響的測(cè)定 采用MTT比色法。消化、收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TT細(xì)胞，使用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成5×104個(gè)/ml單個(gè)細(xì)胞懸液，每孔加200μl，以每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種至96孔板。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24h致細(xì)胞貼壁，分別加入200μl含不同終濃度的紫草素（0.5、1、2、4μg/ml），每組5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立空白對(duì)照組（僅加入完全培養(yǎng)基）。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72h，培養(yǎng)后每孔加MTT溶液（5mg/ml，PBS配制）20μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，在全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（INFINTE M200）測(cè)定各孔光吸收值（OD值），記錄結(jié)果。根據(jù)MTT結(jié)果算抑制率：抑制率=1-OD加藥/OD空白× 100%。

1.2.3 TT細(xì)胞周期分布的改變 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，6孔板內(nèi)每孔接種3×105個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h，待其貼壁。棄上清液，每孔加入3ml含2、4μg/ml紫草素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，并設(shè)立空白對(duì)照組。胰酶消化，收集細(xì)胞，棄上清液，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇，于-20℃固定過(guò)夜。3 000 r/min離心10min，棄上清液，收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，棄上清液，加入200μl細(xì)胞周期染液（Guava Cell Cycle Reagent,美國(guó)Millipore公司）后混勻，避光室溫孵育30min。流式細(xì)胞儀（Guava easycyte plus，美國(guó)Millipore公司）檢測(cè)周期分布。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，6孔板內(nèi)每孔接種3×105個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，待其貼壁。棄上清液，每孔加入3ml含2μg/ml紫草素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h，并設(shè)立空白對(duì)照組。胰酶消化，1 000r/min離心10min收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入200μl AnnexinV-PE及7-AAD的細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑后混勻，避光室溫孵育30min。流式細(xì)胞儀分析紫草素對(duì)TT細(xì)胞凋亡的影響。

1.2.5 透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡和自噬形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以3×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中，接種12h后進(jìn)行加藥處理。空白對(duì)照組細(xì)胞（僅加入F-12K完全培養(yǎng)基）和處理組（以濃度為2、4μg/ml的紫草素處理TT細(xì)胞）細(xì)胞分別經(jīng)溫PBS液洗滌2～3次，刮取細(xì)胞并將其移入離心管中，1 000r/min離心5min，棄上清液；細(xì)胞沉淀采用2%戊二醛4℃預(yù)固定2h，PBS洗滌3次，在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過(guò)夜，將經(jīng)過(guò)滲透處理的樣品包埋，70℃加熱過(guò)夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機(jī)中切片，獲得70～90nm的切片，該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，透射電鏡中觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用表示，組間比較較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)TT細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，不同濃度紫草素作用24～72h對(duì)TT細(xì)胞增殖均有抑制作用，并隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，詳見(jiàn)表1。

表1 不同濃度紫草素作用TT細(xì)胞的抑制率（%）

2.2 紫草素對(duì)TT細(xì)胞周期分布的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TT細(xì)胞空白對(duì)照組細(xì)胞周期時(shí)未發(fā)現(xiàn)G0/G1期前的亞二倍體峰（凋亡峰），2μg/ml濃度的紫草素處理細(xì)胞24h開(kāi)始出現(xiàn)亞二倍體峰；紫草素濃度4μg/ml以上處理細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)明顯的G0/G1期前的亞二倍體峰（凋亡峰）（圖2），與空白對(duì)照組細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同濃度紫草素作用TT細(xì)胞24h細(xì)胞周期的變化：M1、M2、M3細(xì)胞周期的百分比經(jīng)藥物作用后分別與空白對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯增高（P＞0.05），即對(duì)細(xì)胞周期百分比的影響未見(jiàn)明顯變化，詳見(jiàn)表2。

表2 不同濃度紫草素作用24h TT細(xì)胞周期分布的變化（%）

2.3 紫草素誘導(dǎo)TT細(xì)胞凋亡 為了進(jìn)一步證實(shí)亞二倍體峰為凋亡峰，應(yīng)用7-AAD及AnnexinV-PE雙標(biāo)記染色測(cè)定細(xì)胞凋亡。與空白對(duì)照組相比，2μg/ml濃度的紫草素作用TT細(xì)胞24h，早期凋亡（AnnexinV-PE+/7-AAD-）細(xì)胞從0.2%（空白對(duì)照組）增至8.0%；凋亡后期繼發(fā)壞死（AnnexinV-PE+/7-AAD+）細(xì)胞，從0.1%（空白對(duì)照組）增至11.3%；紫草素處理48h后，早期凋亡細(xì)胞上升為24.9%，凋亡后期繼發(fā)壞死細(xì)胞上升為14.2%（圖3）。

2.4 透射電鏡樣品制備與觀察TT細(xì)胞凋亡的形態(tài) 透射電鏡觀察空白對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞器、細(xì)胞核、染色體形態(tài)和分布均正常（圖4）。透射電鏡觀察2μg/ml紫草素作用24h后TT細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)兩種典型的形態(tài)改變：凋亡（圖5）和自噬體的形成（圖6）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析空白對(duì)照組和2μg/ml紫草素作用24、48h對(duì)TT細(xì)胞凋亡的影響（A：空白對(duì)照組；B：2μg/ml紫草素作用24h；C：2μg/ml紫草素作用48h）

圖4 透射電鏡：空白對(duì)照組細(xì)胞，各細(xì)胞器、細(xì)胞核、染色體形態(tài)和分布均正常（×25 000）

圖5 透射電鏡：2μg/ml紫草素作用24h的TT細(xì)胞，細(xì)胞全面皺縮，但胞膜結(jié)構(gòu)保持完整，胞核固縮或崩解而彌散在胞質(zhì)內(nèi)，染色質(zhì)濃縮并邊緣化（×8 000）

3 討論

MTC 1959年由Hazard首次描述，其生物學(xué)惡性度介于甲狀腺分化癌（乳頭狀癌和濾泡癌）與未分化癌之間，預(yù)后較乳頭狀癌和濾泡狀癌差。目前手術(shù)切除仍是其首選根治方式，然而在確診的同時(shí)大約50%～80%的患者已發(fā)生了頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而對(duì)于進(jìn)展期或晚期伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者手術(shù)難以徹底清除腫瘤，許多患者無(wú)法實(shí)施根治性手術(shù)。近年來(lái)中藥極其提取物在抗腫瘤方面取得了很好的成績(jī)，積極尋求對(duì)MTC治療有效的藥物具有重要意義。

圖6 透射電鏡：2μg/ml紫草素作用24h的TT細(xì)胞，胞內(nèi)出現(xiàn)典型的自噬囊泡：雙層膜包繞的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)（×25 000）

紫草為紫草科多年生草本植物新疆紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根，在我國(guó)有悠久的藥用歷史，作為中藥最早記載于東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱涼血，活血，解毒透疹之功效，治溫?zé)岚哒睢駸狳S疸、丹毒、癰瘍等。紫草素是從紫草的根部提取的一種萘醌類(lèi)化合物，現(xiàn)代研究表明紫草素及其衍生物有多種藥理作用，如抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗真菌、抗病毒、促進(jìn)傷口愈合等[2-5,8-10]。

紫草素的抗腫瘤作用首次被報(bào)道是在1977年，Sankawa指出5～10mg/（kg·d）的紫草素能有效對(duì)抗腹水腫瘤的活性，并在1981年應(yīng)用X線對(duì)紫草素、紫草及其衍生物進(jìn)行了分析，得出紫草、紫草素及其衍生物具有抗腫瘤的特性[11-12]。此后國(guó)內(nèi)外對(duì)紫草素的抗腫瘤作用有了很多進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，紫草素具有抗腫瘤效果，對(duì)HL60人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系[13]、肝癌[14]、前列腺癌[14]、大腸癌[15]、口腔鱗癌[16]、基底細(xì)胞癌[17]、骨肉瘤[18]均有作用，影響腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、分化、信號(hào)傳遞、基因表達(dá)等過(guò)程，阻礙腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度紫草素（0.5～4μg/ml）作用細(xì)胞24h，對(duì)TT細(xì)胞的抑制率由11.3%（0.5μg/ml）上升至51.4%（4μg/ml）；作用48h后，抑制率由15.8%（0.5μg/ ml）上升到62.7%（4μg/ml）。相同濃度的紫草素組對(duì)TT細(xì)胞增殖抑制率隨著時(shí)間的增加而上升。紫草素對(duì)TT細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量和時(shí)間雙重依賴(lài)性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)空白對(duì)照組細(xì)胞周期分布時(shí)未發(fā)現(xiàn)G0/G1期前的亞二倍體峰(凋亡峰)，2μg/ml濃度的紫草素處理細(xì)胞24h開(kāi)始出現(xiàn)亞二倍體峰；4μg/ml紫草素處理組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期前的亞二倍體峰；但未改變TT細(xì)胞周期的分布，提示紫草素抑制TT細(xì)胞增殖不是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的途徑。

細(xì)胞凋亡早期改變之一是磷脂酞絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外。在正常細(xì)胞中，PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35～36kD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，2μg/ml濃度的紫草素作用TT細(xì)胞24h，早期凋亡細(xì)胞從0.2%（空白對(duì)照組）增至11.3%，凋亡后期繼發(fā)壞死的細(xì)胞，從0.1%（空白對(duì)照組）增至8.0%；2μg/ml紫草素處理48h后，早期凋亡細(xì)胞增至24.9%；凋亡后期繼發(fā)壞死的細(xì)胞，增至14.2%。這些結(jié)果表明，隨著藥物作用時(shí)間的上升紫草素誘導(dǎo)TT細(xì)胞凋亡和壞死的水平上升。

本研究以透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)部分典型的凋亡形態(tài)：微絨毛消失，細(xì)胞全面皺縮，細(xì)胞核碎裂，染色質(zhì)濃聚形成半月體，細(xì)胞膜發(fā)泡，同時(shí)可見(jiàn)凋亡小體。此外，本研究通過(guò)電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，紫草素處理TT細(xì)胞24h后，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)獨(dú)立雙層膜，且大部分呈彎曲或C型，另有一些雙層膜已包繞部分胞質(zhì)或細(xì)胞器，甚至部分細(xì)胞核，形成封閉的雙側(cè)膜囊泡，即自噬體，表明紫草素誘導(dǎo)的TT細(xì)胞死亡中,有細(xì)胞發(fā)生了自噬性活化?？瞻讓?duì)照組以0.1%的DMSO處理細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器、細(xì)胞核、染色體形態(tài)和分布均正常，未見(jiàn)凋亡或自噬的典型形態(tài)。

綜上所述，紫草素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬抑制使人MTC TT細(xì)胞增殖，筆者將對(duì)紫草素誘導(dǎo)TT細(xì)胞凋亡及自噬的分子機(jī)制做進(jìn)一步研究。

[1]Cohen M S,Moley J F.Surgical treatment of medullary thyroid carcinoma.[J].Intern Med,2003,253(6)：616-626.

[2]Sankawa U,Ebizuka Y,Miyazaki T,et al.Antitumor activity of shikonn and its derivatives[J].Chem Pharm Bull(Tokyo),1977,25(9)：2392-2395.

[3]Sankawa U,Otsuka H,Kataoka Y,et al.Antitumor activity of shikonin,alkannin and their derivatives.II.X-ray analysis of cy-clo-alkannin leucoacetate,tautomerism of alkannin and cyclo-alkannin and antitumor activity of alkannin derivatives[J]. Chem Pharm Bull(Tokyo),1981,29(1)：116-122.

[4]Su Y,Xie J,Wang Y,et al.Synthesis and antitumor activity of new shikonin glycosides[J].Eur J Med Chem,2010,45(7)：2713-2718.

[5]Kontogiannopoulos K N,Assimopoulou A N,Tsivintzelis I,et al. Electrospun fiber mats containing shikonin and derivatives with potential biomedical applications[J].Int J Pharm,2011,409(1-2)：216-228.

[6]Minemura K,Takeda T,Minemura K,et al.Cell-specific induction of sensitivity to ganciclovir in medullary thyroid carcinoma cells by adenovirus-mediated gene transfer of herpes simplex virus thymidine kinase[J].Endocrinology,2000,141(5)：1814-1822.

[7]Soler M N,Milhaud G,Lekmine F,et al.Treatment of medullary thyroid carcinoma by combined expression of suicide and interleukin-2 genes[J].Cancer Immunol Immunother,1999,48(2-3)：91-99.

[8]Sasaki K,Abe H,Yoshizaki F.In vitro antifungal activity of naphthoquinone derivatives[J].Biol Pharm Bull,2002,25(5)：669-670.

[9]Tanaka S,Tajima M,Tsukada M,et al.A comparative study on anti-inflammatory activities of the enantiomers,shikonin and alkannin[J].J Nat Prod,1986,49(3)：466-469.

[10]Papageorgiou V P,Assimopoulou A N,Ballis A C.Alkannins and shikonins：a new class of wound healing agents[J].Curr Med Chem,2008,15(30)：3248-3267.

[11]Sankawa U,Ebizuka Y,Miyazaki T,et al.Antitumor activity of shikonin and its derivatives[J].Chem Pharm Bull(Tokyo),1977, 25(9)：2392-2395.

[12]Sankawa U,Otsuka H,Kataoka Y,et al.Antitumor activity of shikonin,alkannin and their derivatives.II.X-ray analysis of cyclo-alkannin leucoacetate,tautomerism of alkannin and cyclo-alkan nin and antitumor activity of alkannin derivatives[J]. Chem Pharm Bull(Tokyo),1981,29(1)：116-122.

[13]Hashimoto S,Xu M,Masuda Y,et al.beta-hydroxyisovaleryl-shikonin inhibits the cell growth of various cancer cell lines and induces apoptosis in leukemia HL-60 cells through a mechanism different from those of Fas and etoposide[J].J Biochem, 1999,125(1)：17-23.

[14]Yang H,Zhou P,Huang H,et al.Shikonin exerts antitumor activity via proteasome inhibition and cell death induction in vitro and in vivo[J].Int J Cancer,2009,124(10)：2450-2459.

[15]Hsu P C,Huang Y T,Tsai M L,et al.Induction of apoptosis by shikonin through coordinative modulation of the Bcl-2 family, p27,and p53,release of cytochrome c,and sequential activation of caspases in human colorectal carcinoma cells[J].J Agric Food Chem,2004,52(20)：6330-6337.

[16]Nam K N,Son M S,Park J H,et al.Shikonins attenuate microglial inflammatory responses by inhibition of ERK,Akt,and NF-kappaB：neuroprotective implications[J].Neuropharmacology,2008, 55(5)：819-825.

[17]Min R,Tong J,Wenjun Y,et al.Growth inhibition and induction of apoptosis in human oral squamous cell carcinoma Tca-8113 cell lines by Shikonin was partly through the inactivation of NF-kappaB pathway[J].Phytother Res,2008,22(3)：407-415.

[18]Chang I C,Huang Y J,Chiang T I,et al.Shikonin induces apoptosis through reactive oxygen species/extracellular signal-regulated kinase pathway in osteosarcoma cells[J].Biol Pharm Bull,2010,33(5)：816-824.

[19] 黃河,劉宗潮.紫草素及其衍生物的抗腫瘤作用[J].腫瘤防治雜志, 2005,12(1)：75-78.

Shikonin induces apoptosis of human thyroid carcinoma TT cells

Objective To investigate the effect of shikonin on proliferation of human thyroid carcinoma TT cells.MethodsHuman thyroid carcinoma TT cells were treated with shikonin in vitro.Cell proliferation was examined by MTT method,cell apoptosis was detected by flow cytometry.ResultsMTT assay showed that shikonin inhibited TT cell proliferation in a dose-and time-dependent manner(P＜0.01).Flow cytometry revealed sub-diploid(apoptosis)peaks in TT cells after treated with shikonin 2μg/ml and 4μg/ml for 24h;however,there was no cell cycles arrest.Annexin V-PE/7-AAD staining also demonstrated cell apoptosis.Electron microscopy showed typical morphological characteristics of autophagy and cell apoptosis after treatment of shikonin.ConclusionShikonin can inhibit proliferation of human thyroid carcinoma TT cells,which is associated with the cell apoptosis and autophagy.

Shikonin Medullary carcinoma of thyroid Cell proliferation Cell apoptosis

2013-08-09）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省自然基金課題（LY13H130003）

310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（唐旭霞）；浙江省人民醫(yī)院外科（葉再元）

葉再元，E-mail:yezhaiyuan@163.com