SOCS超甲基化在經(jīng)典型慢性骨髓增殖性腫瘤發(fā)病中的作用研究

李伶俐 沈志紅 戎永楚 康程 戎奇吉 梁愛斌

●論 著

SOCS超甲基化在經(jīng)典型慢性骨髓增殖性腫瘤發(fā)病中的作用研究

李伶俐 沈志紅 戎永楚 康程 戎奇吉 梁愛斌

目的 探討細胞因子信號傳導抑制蛋白（SOCS）基因超甲基化在經(jīng)典型慢性骨髓增殖性腫瘤（MPN）發(fā)病機制中的作用。方法采用甲基化特異性PCR法檢測220例MPN患者骨髓標本中SOCS1、SOCS3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化發(fā)生情況，直接測序法檢測MPN患者JAK2V617F、MPLW515L/K基因突變情況。應用粒細胞集落刺激因子化學誘導MPN細胞生長不同時間后，采用實時定量PCR和蛋白印跡法檢測SOCS1、SOCS3 mRNA及其蛋白表達情況。同時，加入去甲基化試劑培養(yǎng)MPN細胞不同時間后，實時定量PCR法檢測SOCS1、SOCS3 mRNA表達情況。結果MPN患者中44例（20．0%）存在SOCS1基因超甲基化，90例（40．9%）存在SOCS3基因超甲基化，156例（70．9%）JAK2V617F突變陽性，3例JAK2V617F未突變的原發(fā)性血小板增多癥患者檢測到MPLW515突變（其中2例為MPLW515L，1例為MPLW515K），2例JAK2V617F未突變原發(fā)性骨髓纖維化患者檢測到MPLW515L突變；SOCS1、SOCS3基因超甲基化組與未甲基化組相比，其SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白表達量明顯減少（P＜0．05）；JAK2V617突變組與無突變組相比，其SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白表達量明顯減少（P＜0．05）；SOCS1、SOCS3基因超甲基化組，加入去甲基化試劑后SOCS1、SOCS3 mRNA表達量明顯升高（P＜0．05）。結論MPN患者中存在高頻率的JAK2V617F基因突變和低頻率的MPL基因突變以及SOCS基因啟動子區(qū)CpG島超甲基化；SOCS超甲基化和JAK2V617F突變導致SOCSmRNA和蛋白表達水平降低，異常激活JAK/STAT信號傳導通路，引起細胞代謝失常而最終影響MPN的發(fā)生、發(fā)展；SOCS超甲基化是一種潛在的MPN診斷生物分子標志物及治療靶標。

骨髓增殖性腫瘤 細胞因子信號傳導抑制蛋白 JAK2基因突變 MPL基因突變 JAK/STAT信號傳導通路

【Keywords】Myeloproliferative diseases Suppressor of cytokine signaling JAK2 mutation MPL mutation JAK/STAT signaling

細胞因子信號傳導抑制蛋白（supperssor of cytokine signaling，SOCS）家族是一類對多種細胞因子和生長相關因子信號傳導過程起負性調(diào)節(jié)作用的胞質(zhì)蛋白分子，主要包括CIS和SOCS1～7等8個成員，是截至目前研究得較為透徹的JAK/STAT通路的重要反饋抑制物。SOCS1、SOCS3是SOCS家族的重要分子，可以被多種細胞因子快速誘導表達，我們選擇SOCS1、SOCS3作為研究對象，探討SOCS基因家族在經(jīng)典型骨髓增殖性腫瘤（MPN）發(fā)病中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2006-12—2012-12上海同濟大學附屬同濟醫(yī)院和慈溪市人民醫(yī)院血液科門診及住院的經(jīng)典型慢性骨髓增殖性腫瘤（MPN）患者220例（上海同濟大學附屬同濟醫(yī)院130例，慈溪市人民醫(yī)院90例），其中男119例，女101例，年齡18～85（51.6±10.2）歲。參照WHO分類標準進行診斷分類，其中真性紅細胞增多癥95例，原發(fā)性血小板增多癥87例，原發(fā)性骨髓纖維化38例。根據(jù)甲基化狀態(tài)及JAK2V617F突變情況將其進一步分為甲基化組與未甲基化組、突變組與無突變組。選擇同期慈溪市人民醫(yī)院健康志愿者50例作為對照組，其中男28例，女22例，年齡18～55（40.2±4.1）歲。MPN患者與對照組健康志愿者性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。所有患者與健康志愿者均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 DNAzol、TRIzol和M-MLV逆轉錄酶由美國Invitrogen公司提供。熱啟動Taq DNA聚合酶由德國QIAGEN公司提供。蝦堿和外切酶由美國Applied Biosystems公司提供。細胞核/細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒及RNA分離試劑由北京天根生化科技有限公司提供。甲基化修飾試劑和去甲基化試劑由美國Zymo Research公司提供。化學誘導劑粒細胞集落刺激因子由深圳新鵬生物工程有限公司提供。胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)液由美國Gibco公司提供?？谷薙OCS1、SOCS3單克隆抗體由美國Santa Cruz公司提供。引物和探針均由上海生工生物技術服務有限公司合成。

1.2.2 標本采集及處理 采集兩組骨髓3～5ml，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞，-80℃保存待用。

1.2.3 PCR反應 （1）PCR擴增及測序：應用DNAzol試劑盒提取總DNA。JAK2V617F、MPLW515引物序列見表1。（2）PCR反應體系：80ng基因組DNA、MgCl21.25mmol/ L、dNTP0.2mmol/L、Taq酶2U、上下游引物各15pmol，總體積50μl。（3）反應條件：94℃5min；94℃30 s，60℃40s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物采用蝦堿酶和外切酶純化，純化產(chǎn)物采用ABI3700測序儀測序。

1.2.4 甲基化特異性PCR 應用DNAzol試劑盒提取DNA，與S-腺苷甲硫氨酸（終濃度為160mmol/L）、1×NE緩沖液Ⅱ和1U CpG甲基轉移酶M.SSSⅠ酶混合，37℃孵育2h后再經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾；引物設計見表 1。25μlPCR反應總體系含 10×PCR緩沖液 2.5μl、dNTP2.0μl、熱啟動 Taq酶 0.25μl，上下游引物各20pmol、模板DNA4μl，補足水至25μl。反應條件為94℃熱啟動11min后開始40個循環(huán)：94℃45s，60℃45s，72℃45s，最后于72℃延伸12min，4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠（PI）染色后在紫外燈下觀察，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5 實時定量RT-PCR檢測SOCS1、SOCS3mRNA水平 選取SOCS1、SOCS3甲基化MPN患者各8例（4例JAK2突變型，4例JAK2野生型），SOCS1、SOCS3未甲基化MPN患者各8例（4例JAK2突變型，4例JAK2野生型），對照組6例，抽取骨髓各5ml，經(jīng)肝素抗凝，用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞，將細胞分別置于盛有RPMI1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。SOCS1、SOCS3甲基化組和未甲基化組各3瓶，對照組3瓶，每瓶細胞密度≥5×106個，并加入化學誘導劑150μmol/L G-CSF，分別誘導0、1和4h。取SOCS1、SOCS3甲基化組和對照組各3瓶，加入去甲基化試劑5-氮雜脫氧胞苷（5-Aza-2′-deoxyazacytidin，5-Aza-dCR）終質(zhì)量濃度為1.0g/cm3，分別反應0、24和48h。收集上述處理后的各組細胞，用TRIZOL法提取總RNA逆轉錄成cDNA。SOCS1探針序列為5′-FAM-CTGGAGCCAGGACCTGAACTCGCACCTAMRA-3′；SOCS3探針序列為5′-FAM-TCGCCACCTACTGAACCCTCCTCCG-TAMRA-3′；人類GAPDH探針序列為5′-FAM-GGCTGAGAACGGGAAGCTTG-TAMRA-3′。引物序列見表1。以人293細胞cDNA為模板，用SOCS1、SOCS3、HGAPDH基因引物進行PCR擴增，膠回收擴增產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接回收后產(chǎn)物與T載體，構建TA克隆，轉化至DH5a感受態(tài)細胞，通過菌落PCR篩選陽性克隆，分析測序結果并保留測序正確的克隆。用微量紫外分光光度計Thermo NanoDrop測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)公式計算2個基因的TA克隆質(zhì)粒的的基因拷貝數(shù)，制作2個基因的的標準品。PCR反應體系為25μl，含10×緩沖液2.5μl、MgCl22.0mmol/L、dNTP0.2mmol/L、上下游引物各0.5μmol/L、探針0.5μmol/L、Taq酶1.0U和cDNA50ng。反應條件：94℃5min，95℃30 s，55℃45 s，共40個循環(huán)。

表1 PCR引物序列

1.2.6 檢測SOCS1、SOCS3蛋白表達水平 收集上述經(jīng)G-GSF誘導0、24的48h和MPN細胞和對照細胞，采用細胞核/細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，半干法轉膜，分別加入1∶500稀釋的兔抗人SOCS1、SOCS3和兔抗GAPDH，4℃過夜，再加入1∶5 000稀釋辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，室溫下孵育1～2h后用電化學發(fā)光試劑顯色，最后圖像掃描并分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 JAK2V617F和MPLW515基因突變篩查結果 220例MPN患者中共有156例（70.9%）存在JAK2V617F突變（其中雜合子型149例，純合子型7例），包括真性紅細胞增多癥91例（91/95，95.8%），原發(fā)性血小板增多癥46例（46/87，52.9%），原發(fā)性骨髓纖維化19例（19/38，50.0%）。64例JAK2V617F無突變的患者中有5例（5/220，2.3%）檢測到MPLW515突變，包括原發(fā)性血小板增多癥3例（3/87，3.4%），其中MPLW515L 2例，MPLW515K 1例；原發(fā)性骨髓纖維化2例（2/38，5.3%），均為MPLW515L突變。對照組無JAK2V617F或MPLW515突變。

2.2 MPN患者JAK2突變組與無突變組SOCS1、SOCS3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化檢出情況 見表2，圖1、2。

表2 MPN患者JAK2突變組與無突變組SOCS1、SOCS3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況（例）

由表2可見，MPN患者中44例（20.0%）存在SOCS1基因超甲基化，包括真性紅細胞增多癥15例（15/ 95，15.8%），以原發(fā)性血小板增多癥18例（18/87，20.7%），原發(fā)性骨髓纖維化11例（11/38，28.9%），以原發(fā)性骨髓纖維化患者頻率最高，但3種病變患者的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.980，P＞0.05）。90例（40.9%）存在SOCS3基因超甲基化，包括真性紅細胞增多癥42例（42/95，44.2%），原發(fā)性血小板增多癥34例（34/87，39.1%），原發(fā)性骨髓纖維化14例（14/38，36.8%），3種病變患者的SOCS3基因甲基化率的差異也無統(tǒng)計學意義（χ2=0.809，P＞0.05）。MPN患者中，JAK2V617F突變組與無突變組，SOCS1、SOCS3基因甲基化率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.088，4.702；P=0.0854，0.035＞0.05）。對照組未發(fā)現(xiàn)有SOCS1、SOCS3基因超甲基化。

2.3 G-CSF處理不同時間后MPN細胞SOCS1、SOCS3 mRNA表達水平的變化 見圖3。

圖1 SOCS1甲基化特異性PCR檢測結果（1：SOCS1甲基化；2：SOCS1非甲基化；3：陰性對照；m：甲基化引物；u：非甲基化引物；M：DNA標記）

圖2 SOCS3甲基化特異性PCR檢測結果（1、2：SOCS3非甲基化；3：SOCS3甲基化；m：甲基化引物；u：非甲基化引物；M：DNA標記）

圖3 G-CSF處理不同時間后MPN細胞SOCS1、SOCS3 mRNA表達水平的變化（N：對照組；UM：未甲基化組；M：甲基化組）

由圖3可見，各組在G-CSF誘導0、1和4h后SOCS1、SOCS3基因表達水平升高。G-CSF誘導前，甲基化組SOCS1、SOCS3 mRNA表達平均水平低于非甲基化組和對照組（P＜0.05）。經(jīng)G-CSF誘導后，未甲基化組和對照組SOCS1、SOCS3 mRNA表達持續(xù)上升，甲基化組SOCS1、SOCS3 mRNA表達仍然處于低水平，顯著低于非甲基化組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 G-CSF處理不同時間后MPN細胞SOCS1、SOCS3蛋白表達水平的變化 見圖4。

由圖4可見，G-CSF誘導前，各組SOCS1、SOCS3蛋白表達水平均較低，甲基化組低于對照組和未甲基化組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在G-CSF誘導24h時，未甲基化組和對照組SOCS1、SOCS3蛋白表達水平均顯著上升，甲基化組仍處于低水平；對照組的SOCS1蛋白表達水平48h時仍持續(xù)上升，而SOCS3蛋白表達水平24h后急劇下降；未甲基化組SOCS1、SOCS3蛋白表達水平顯著高于甲基化組（P＜0.05），且在G-CSF誘導下有持續(xù)升高的趨勢。

圖4 G-CSF處理不同時間后MPN細胞SOCS1、SOCS3蛋白表達水平的變化（N：對照組；UM：未甲基化組；M：甲基化組）

2.5 JAK2V617F突變對SOCS1、SOCS3mRNA和蛋白表達水平的影響 見圖5。

由圖 5可見，SOCS1、SOCS3未甲基化組中的JAK2V617F突變組SOCS1、SOCS3mRNA和蛋白表達水平均明顯低于JAK2V617F無突變組（均P＜0.05）。SOCS1、SOCS3甲基化組中的JAK2V617F突變組和JAK2V617F無突變組SOCS1、SOCS3mRNA和蛋白表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.6 去甲基化對SOCS1、SOCS3mRNA表達水平的影響見圖6。

由圖6可見，在G-CSF誘導下，甲基化組加入去甲基化試劑孵育0、24和48h后SOCS1、SOCS3mRNA表達水平升高，與未加去甲基化試劑的甲基化組和對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；對照組加入去甲基化試劑0、24和48h后，SOCS1、SOCS3mRNA表達水平稍有下降，但與未加去甲基化試劑的對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

目前酪氨酸激酶JAK2突變導致JAK/STAT通路的異常激活被認為是經(jīng)典型MPN發(fā)病的重要分子機制。在絕大多數(shù)的真性紅細胞增多癥患者、約50%的原發(fā)性血小板增多癥患者和原發(fā)性骨髓纖維化患者可檢測到JAK2V617F點突變[1-3]，本研究結果也證實了這一結論。此后，在少數(shù)這些疾病患者中還檢測到JAK2基因其他位點功能類似的點突變[4]。有研究報道在5%的原發(fā)性骨髓纖維化患者和1%的原發(fā)性血小板增多癥患者檢測到位于MPL跨膜區(qū)的MPLW515突變[5]，該突變導致突變細胞發(fā)生細胞因子非依賴性激活，激活下游JAK/STAT途徑。但仍有相當部分MPN患者無JAK2或MPL基因突變，提示還存在其它分子機制參與經(jīng)典型MPN發(fā)病。

圖5 JAK2V617F突變對SOCS1、SOCS3mRNA和蛋白表達水平的影響[（+）指發(fā)生突變或甲基化，（-）指無突變或甲基化]

圖6 去甲基化對SOCS1、SOCS3mRNA表達水平的影響（N：對照組；Aza：去甲基化試劑5-氮雜脫氧胞苷；M：甲基化組）

正常生理情況下，JAK/STAT通路介導促紅細胞生成素、促血小板生成素、粒-巨噬細胞集落刺激因子等多種細胞因子的信號傳導，調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡。SOCS蛋白家族成員作為重要的負調(diào)控因子，參與多種信號傳導途徑的負反饋調(diào)節(jié)，尤其在JAK/STAT通路的負反饋調(diào)節(jié)機制中起著重要作用。SOCS蛋白家族具有共同的結構：中間的SH2結構域；位于N末端的可變序列；位于C末端的由40個氨基酸殘基組成的“SOCS盒”。目前研究認為，SOCS蛋白對細胞因子信號傳導抑制作用主要有3種分子機制：與JAKs結合并抑制其活性；與STATs競爭結合細胞因子受體磷酸化位點，阻止STAT活化；誘導與之結合的JAKs、STATs的降解，從而阻斷細胞因子的信號傳遞。與SOCS家族的其他成員不同，SOCS1、SOCS3還包含有一個由12個氨基酸組成的結構-激酶抑制區(qū)（KIR），可以與JAK2的酪氨酸激酶區(qū)（JH1）結合并使其失活。基因缺失實驗證明不同的SOCS蛋白家族成員具有不同的高度特異性的生理功能。SOCS1、SOCS3在造血細胞的負性調(diào)控中顯得尤為重要[6]。SOCS1基因缺失小鼠表現(xiàn)為發(fā)育障礙，且出生不到3周死亡，伴有嚴重的淋巴細胞減少、T淋巴細胞活化、肝細胞壞死、主要臟器的巨噬細胞浸潤等特征[7-8]。Alexander等[8]進一步研究認為SOCS1在INF-γ信號傳導的調(diào)控和T細胞分化中起著重要作用。Boyle等[9]發(fā)現(xiàn)SOCS3基因缺失小鼠最終發(fā)展為真性紅細胞增多癥，表明SOCS3可能在負性調(diào)控紅細胞生成中起重要作用。

目前研究認為SOCS基因啟動子區(qū)的超甲基化導致基因沉默可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[10-12]。在血液腫瘤中，如急性髓系白血病、MDS常發(fā)現(xiàn)SOCS基因超基化而導致基因沉默[13-14]。最近Teofili[15]等發(fā)現(xiàn)約1/3真性紅細胞增多癥和1/4原發(fā)性血小板增多癥患者存在SOCS1或SOCS3超甲基化（不依賴JAK2V617F突變），導致基因轉錄水平降低，減弱對JAK2/STAT通路的抑制作用，對MPD的發(fā)病起了重要作用。本研究結果證實真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥患者中存在較高頻率的SOCS基因啟動子區(qū)CpG島超甲基化，除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性骨髓纖維化患者中也存在SOCS的超甲基化，研究顯示約1/2真性紅細胞增多癥患者、3/5原發(fā)性血小板增多癥和3/5原發(fā)性骨髓纖維化患者存在SOCS1和/或SOCS3的啟動子區(qū)CpG島的超甲基化且不依賴JAK2V617F突變。同時，本研究未發(fā)現(xiàn)SOCS1、SOCS3甲基化率在真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥及原發(fā)性骨髓纖維化患者中的分布差異有統(tǒng)計學意義。本研究結果顯示SOCS1、SOCS3基因啟動子區(qū)的CpG島超甲基化導致基因表達下調(diào)，且不能通過細胞因子的刺激而升高。而去甲基化實驗則進一步證明超甲基化與基因轉錄沉默的關系。事實上，SOCS1、SOCS3基因啟動子區(qū)的CpG島作為轉錄因子的結合位點，對SOCS1、SOCS3的轉錄激活起著重要作用。這些位點甲基化造成SOCS1、SOCS3表達量下降，不能有效行使其生理功能，對JAK/STAT通路的反饋抑制被削弱，JAK/STAT通路異常激活，導致細胞代謝失常而最終影響MPN的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)SOCS甲基化的頻率和其轉錄抑制效應是一致的，當去甲基化后，SOCS1、SOCS3的轉錄恢復正常，可以重新反饋抑制JAK/STAT通路的活性，誘導細胞凋亡。本研究結果說明SOCS基因超甲基化可能是MPN的重要發(fā)病機制并提示SOCS1、SOCS3超甲基化可能是治療MPN的一種潛在分子靶標。本研究結果表明約2/3的MPN患者由于SOCS基因超甲基化導致基因表達下調(diào)，在體外加入去甲基化試劑可以使其恢復表達。針對這些患者可以設計出一種分子靶向治療方法，使沉默基因去甲基化以恢復正常轉錄?？紤]到還有約1/3的MPN患者JAK2V617F無突變，對這些患者評估SOCS的甲基化狀態(tài)顯得尤為重要。

本研究還發(fā)現(xiàn)JAK2V617F突變對SOCS轉錄水平存在抑制作用。JAK2V617F突變位置恰好位于JAK2假激酶區(qū)（JH2區(qū)），破壞了該區(qū)對酪氨酸激酶區(qū)（JHl區(qū)）的抑制作用，從而發(fā)生JAK2的組成型激活。Hookham等[16]的研究表明，JAK2V617F突變的造血祖細胞對SOCS蛋白的抑制作用產(chǎn)生抵抗性，由于這些患者SOCS表達量無法恢復，因此抑制活化的激酶也不能恢復傳導系統(tǒng)的誘導與抑制之間的平衡。

本研究證實了Pardanani等[5]關于原發(fā)性血小板增多癥和原發(fā)性骨髓纖維化患者中存在MPLW515突變的觀點。該突變的存在驗證了我們先前的推測，即還有其他分子異常參與了MPN的發(fā)病。本研究中5例MPLW515突變患者JAK2V617F均未突變，這一發(fā)現(xiàn)為JAK2V617F未突變的經(jīng)典型MPN患者的發(fā)病機制做了有益補充，但是MPLW515突變率并不高，因此對那些JAK2V617F和MPLW515均未突變的MPN患者，還有其他的分子異常參與發(fā)病。本研究結果顯示SOCS基因啟動子區(qū)CpG島超甲基化可能是MPN發(fā)病的誘發(fā)因素之一，尤其在JAK2V617F未突變的MPN發(fā)病機制中可能起著重要作用。至于MPN患者中SOCS超甲基化、JAK2V617F突變及MPLW515突變3者關系如何，是否還有其他分子機制參與發(fā)病，值得進一步研究。

[1]Baxter E J,Scott L M,Campbell P J,et al．Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders[J]．Lancet,2005,365(9464)：1054-1061．

[2]James C,Ugo v,Le Couedic J P,et al．A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera [J]．Nature,2005,434(7037)：1144-1148．

[3]Levine R L,Wadleigh M,Cools J,et al．Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera,essential thrombocythemia,and myeloid metaplasia with myelofibrosis[J]．Cancer Cell,2005,7(4)：387-397．

[4]Scott L M,Tong W,Levine R L,et al．JAK2 exon 12 mutations in polythemia vera and idiopathic erythrocytosis[J]．N Engl J Med, 2007,356(5)：459-468．[5]Pardanani A D,Levine R L,Lasho T,et al．MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders：a study of 1182 patients[J]．Blood,2006,108(10)：3472-3476．

[6]Valentino L,Pierre J．JAK/STAT signal transduction：regulators and implication in hematological malignancies[J]．Biochem Pharmacol, 2006,71(6)：713-721．

[7]Krebs D L,Hilton D J．SOCS：Physiological suppressors of cytokine signaling[J]．J Cell Sci,2000,113(Pt16),2813-2819．

[8]Alexander W S,Starr R,Fenner J E,et al．SOCS1 is a critical inhibitor of interferonγ signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of this cytokine[J]．Cell,1999,98(5)：597-608．

[9]Boyle K,Robb L．The role of SOCS3 in modulating leukaemia inbihitory factor signaling during murine placental development[J]．J Reprod Immunol,2008,77(1)：1-6．

[10]Xiong H,Du W,Zhang Y J．Tricho station A,a histone deacetylase inhibitor,suppresses JAK2/STAT3 signaling via inducing the promoter-associated histone acetylation of SOCS1 and SOCS3 in human colorectal cancer cells[J]．Mol Carcinog,2012,51(2)：174-184．

[11]Hua D,Hu Y,Wu Y Y,et al．Quantitative methylation analysis of multiplegenesusing methylation-sensitive restrictionenzyme-based quantitative PCR for the detection of hepatocellular carcinoma[J]．Exp Mol Pathol,2011,91(1)：455-460．

[12]Sasi W,Jiang W G,Sharma A,et al．Higher expression levels of SOCS1,3,4,7 are associated with earlier tumor stage and better clinical outcome in human breast cancer[J]．BMC Cancer,2010, 10：178．

[13]Watanabe D,Ezoe S,Fujinoto M,et al．Suppressor of cytokine signaling-1 gene silencing in acute myeloid leukaemia and human haematopoeitic cell lines[J]．Br J Haenatol,2004,126(5)：726-735．

[14]Wu S J,Yao M,Chou W C,et al．Clinical implications of SOCS1 methylation in myelodysplastic syndrome[J]．Br J Haematol, 2006,135(3)：317-323．

[15]Teofili L,Martini M,Cenci T,et al．Epigenetic alteration of SOCS family members is a possible patheogenetic mechanism in JAK2 wild type myeloproliferative diseases[J]．Int J Cancer,2008,123 (7)：1586-1592．

[16]Hookham M B,Elliott J,Suessmuth Y,et al．The myeloproliferative disorder-associated JAK2V617F mutant escape negative regulation by suppressor of cytokine signaling[J]．Blood 2007,109 (11)：4924-4929．

Association between SOCS gene hypermethylation and classical myeloproliferative neoplasms

Objective To investigate the association between hypermethylation of suppressor of cytokine signaling(SOCS) gene and typical myeloproliferative neoplasms(MPN)．MethodsMethylation-specific PCR was used to detect CpG island methylation status of SOCS1 and SOCS3 genes in bone marrow samples from 220 MPN patients．JAK2V617F and MPLW515L/K gene mutations were detected by direct DNA sequencing assay．The expression of SOCS1 and SOCS3mRNA and protein was evaluated by real-time quantitative PCR and Western blot,after MPN cells were co-cultured with GC-SF or demethylating agent 5-aza-2′-deoxyazacytidin at different time points．ResultsThe rates of SOCS1 and SOCS3 gene hypermethylation were 20．0%(44/220)and 40．9%(90/220),respectively．JAK2V617F positive mutation was detected in 156 patients(70．9%);in 3 JAK2V617F-negative patients with essential thrombocytosis(ET),MPLW515 mutation was detected (2 MPLW515L and 1 of MPLW515K)and in 2 JAK2V617F-negative patients with idiopathic myelofibrosis(IMF),MPLW515L mutation was detected．The expression of SOCS1,SOCS3 mRNA and protein was significantly decreased in hypermethylation group compared to non-methylation group(P＜0．05);and in JAK2V617F mutation group compared to wild type group(P＜0．05)．After co-cultured with demethylating agent the expression of SOCS1，SOCS3mRNA was increased significantly in hypermethylation group(P＜0．05)．ConclusionHigh-frequency JAK2V617F gene mutation,low-frequency MPL gene mutation and SOCS gene CpG island hypermethylation are associated with myeloproliferative neoplasms,and SOCS hypermethylation might be a potential diagnosticbiomarker and therapeutic target for the disease．

2013-06-09）

（本文編輯：楊麗）

寧波自然科學基金（2011A610040）

315300 慈溪市人民醫(yī)院檢驗科（李伶俐、沈志紅、戎永楚、康程、戎奇吉）；上海同濟大學附屬同濟醫(yī)院血液科（梁愛斌）通信作者：李伶俐，E-mail：sztext@vip.163.com