響應(yīng)面法優(yōu)化馬奶酒發(fā)酵條件的研究

王 璐，李小溪，古麗娜孜，張晨璐，張 藝，段莉薇，閻曉菲，武 運(yùn)*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

馬奶是新疆少數(shù)民族飲食文化中的瑰寶，至今仍保留著馬奶酒的傳統(tǒng)制作方法。馬奶的營養(yǎng)價(jià)值很高，含有豐富的蛋白質(zhì)、乳糖、維生素和礦物質(zhì)，并含有人體不可缺少的氨基酸和脂肪酸[1]。草原鮮馬奶雜質(zhì)少，用其釀出的馬奶酒所含甲醇、異丁醇、異戊醇成分極低，鉛、汞等重金屬含量低于國家標(biāo)準(zhǔn)的10%，甲醛的含量更是少之又少。此外，馬奶酒的營養(yǎng)價(jià)值也很高，氨基酸的總量比新鮮馬奶高約51%[2-4]。

目前，有部分關(guān)于奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化的研究[5-8]，但采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬奶酒發(fā)酵條件的文章較少，針對以上現(xiàn)狀，為充分開發(fā)利用新疆馬奶資源，提高馬奶綜合經(jīng)濟(jì)效益，本試驗(yàn)主要以新疆烏魯木齊南山地區(qū)新鮮馬奶為原料，通過單因素試驗(yàn)確定馬奶酒發(fā)酵工藝，采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬奶酒發(fā)酵條件的最佳參數(shù)，為新疆新鮮馬奶的工業(yè)化生產(chǎn)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮馬奶：新疆烏魯木齊南山地區(qū)。

乳酸菌、酵母菌：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸二胺2g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，吐溫-80 1mL，蒸餾水1000mL。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。

1.2 儀器與設(shè)備

MST-401 JM10002型電子秤：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；LD2X-50KB型立式電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器廠；DZKW-172電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫(yī)療儀器廠；CH2176J微電腦電磁爐：中山市格蘭仕生活電器制造有限公司；SXKW數(shù)顯控溫電熱套：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；HR40-ⅡA2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；WFI-J型手持測糖儀：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬奶酒加工工藝流程

新鮮馬奶→過濾→殺菌→冷卻→接種乳酸菌和酵母菌→酒精發(fā)酵→灌裝→成品

1.3.2 分析測定方法

酒精度測定：用酒精計(jì)進(jìn)行測定；酸度測定：用酸堿滴定法進(jìn)行測定；還原糖測定：用糖度計(jì)進(jìn)行測定。理化、衛(wèi)生指標(biāo)測定：參考GB/T 23546—2009《奶酒》[9]。

感官指標(biāo)：采用綜合評分法，在有明亮自然光、溫度為25℃的房間內(nèi)進(jìn)行馬奶酒感官評定。感官評分標(biāo)準(zhǔn)（滿分100分）見表1。

表1 馬奶酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria of Kumiss

1.3.3 操作要點(diǎn)

（1）馬奶的預(yù)處理

原料奶需無添加劑、無異味的新鮮馬奶，用4層紗布過濾將馬奶中的雜質(zhì)和異物除去。再將馬奶加熱至90～95℃，保持30s殺菌，放置冷卻至室溫，待發(fā)酵用。

（2）種子發(fā)酵液及母發(fā)酵液的制備

種子發(fā)酵液：將4℃保存的乳酸菌與酵母菌菌種在無菌環(huán)境下接種于MRS、YPD培養(yǎng)基中活化，分別置于37℃培養(yǎng)24h、28℃培養(yǎng)48h，以備后期使用[10]。

母發(fā)酵液：將預(yù)處理好的馬奶分裝于三角瓶中，在無菌條件下，將已活化好的乳酸菌與酵母菌種子發(fā)酵液按5%接種量接入三角瓶中，搖勻，分別置于37℃培養(yǎng)24h、28℃培養(yǎng)48h。

1.3.4 馬奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

分別選取接菌量（乳酸菌/酵母菌）為2%∶6%、3%∶5%、4%∶4%、5%∶3%、6%∶2%，發(fā)酵溫度為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，發(fā)酵時(shí)間為24h、48h、72h、96h、120h，糖添加量為4%、6%、8%、10%、12%；進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗(yàn)，通過測定酒精度、酸度、糖度以及感官評分進(jìn)行單因素考察。

（2）響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理分別對影響酒精度（Y）的3個(gè)因素：接菌量（乳酸菌/酵母菌）（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C），利用響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.05軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平編碼值見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平編碼值Table 2 Factors and levels of response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 影響馬奶酒發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同接菌量對發(fā)酵的影響

表3 不同接菌量對發(fā)酵的影響Table 3 Effect of different inoculum on fermentation

酵母菌的含量是影響酒精發(fā)酵的重要因素之一[11]。由表3可知，當(dāng)酵母菌所占的比例較少時(shí)，馬奶酒的酒精含量較低。酒精積累量隨添加酵母菌比例的增大而升高，當(dāng)接菌量（乳酸菌%/酵母菌%）比例為3%∶5%，酸馬奶酒的酒精含量最高，糖度與酸度均較低，說明大量的糖與酸都轉(zhuǎn)化成了酒精，并且與感官評價(jià)結(jié)果相符合，因此選擇接菌量（乳酸菌%/酵母菌%）比例3%∶5%最為合適。

2.1.2 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響

表4 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響Table 4 Effect of different temperature on fermentation

發(fā)酵溫度對菌體的生長繁殖有很大的影響，只有在適宜的溫度范圍內(nèi)才能生長并起發(fā)酵作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12]，發(fā)酵溫度是影響果酒風(fēng)味的主要因素。由表4可知，當(dāng)溫度為30℃時(shí)，馬奶酒酒精含量達(dá)到最高為1.2%vol，但當(dāng)發(fā)酵溫度過高超過30℃時(shí)，酵母的繁殖和發(fā)酵能力反而下降，酒精的積累也逐漸減少，感官評價(jià)得分最高的也是在發(fā)酵溫度為30℃時(shí)獲得，因此選擇30℃為最為最佳發(fā)酵溫度。

表5 不同發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵的影響Table 5 Effect of different time on fermentation

2.1.3 不同發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵的影響

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酵母菌充分生長，酒精度也逐漸升高。由表5可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72h時(shí)是個(gè)拐點(diǎn)，24～72h間馬奶酒的酒精含量逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在72～120h時(shí)，馬奶酒的酒精積累量明顯降低，結(jié)合感官評價(jià)發(fā)酵72h的馬奶酒分?jǐn)?shù)最高為83，說明馬奶酒的甜度、酸度、酒精度適中，口感較好，因此選擇發(fā)酵時(shí)間為72h。

2.1.4 不同糖添加量對發(fā)酵的影響

表6 不同糖添加量對發(fā)酵的影響Table 6 Effect of different sugar addition on fermentation

菌株的發(fā)酵能力在一定范圍內(nèi)隨著碳源的增加而增強(qiáng)，添加蔗糖為酵母菌和乳酸菌提供了豐富的碳源，增強(qiáng)了菌株的發(fā)酵能力，使得馬奶酒的酒精含量、糖度、酸度都高于前幾組單因素試驗(yàn)結(jié)果。由表6可知，加糖量在4%～8%時(shí)，酒精度積累量逐漸增加，但當(dāng)加糖量超過8%時(shí)，發(fā)酵能力平緩并有下降的趨勢，可能是因?yàn)樘砑诱崽呛窟^高，馬乳中的糖濃度過高，抑制了酵母菌和乳酸菌的生長，從而使得酒精度下降，糖度和酸度較高。感官評價(jià)結(jié)果顯示添加糖含量為6%時(shí)，馬奶酒的口感較好。因此，綜合以上原因選擇加糖量為6%最為恰當(dāng)。

2.2 馬奶酒發(fā)酵響應(yīng)面優(yōu)化分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對酒精發(fā)酵影響較大的3個(gè)因素（接菌量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度）作為響應(yīng)因素，采用Box-Behnken Design響應(yīng)面分析法對其進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果見表7。

按照表7試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，以馬奶酒酒精度（Y）為響應(yīng)值可建立以馬奶酒酒精度對接菌量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）的擬合方程：

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Experimental design and result of response surface methodology

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析Table 8 Variance analysis of response surface experiment results

回歸方程中各變量對指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來判定，概率P的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高[13-15]。由表8可知，當(dāng)模型F=68.44時(shí)，P＜0.000 1，說明模型是極顯著的。當(dāng)失擬項(xiàng)F=1.12時(shí)，P=0.440 4＞0.05，說明模型失擬項(xiàng)不顯著。決定系數(shù)R2=0.988 8，校正系數(shù)R2Adj=0.974 2，表明酒精度的實(shí)測值與預(yù)測值之間具有很好的擬合度，由此可以說明模型的建立呈顯著性，試驗(yàn)操作準(zhǔn)確可信，因此可以利用此模型對馬奶酒發(fā)酵過程進(jìn)行分析和預(yù)測。

從表8可知，一次項(xiàng)與二次項(xiàng)均對馬奶酒的Y值影響表現(xiàn)出極顯著水平，交互項(xiàng)AB、AC對馬奶酒Y值的影響表現(xiàn)為顯著水平，交互項(xiàng)BC對馬奶酒Y值的影響不具有顯著水平的影響。試驗(yàn)結(jié)果可以得出各因素對馬奶酒酒精度的影響A＞C＞B，即接種量比例＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面圖與等高線圖分析

為了考察各個(gè)交互項(xiàng)對馬奶酒酒精度的影響，在其他因素固定不變的情況下，利用Design-Expert 8.05軟件對回歸方程進(jìn)行運(yùn)算，作出交互項(xiàng)的三維響應(yīng)面圖及等高線圖，能比較直觀的解釋各個(gè)變量和變量之間對響應(yīng)值的影響。

圖1 各因素相互作用對馬奶酒酒精發(fā)酵影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot of interaction among each two factors of inoculums,fermentation temperature and time on Kumiss fermentation

由圖1可以看出，隨著接菌量比例的變化，酒精度呈先上升后下降的趨勢，發(fā)酵時(shí)間對馬奶酒酒精度影響不明顯，其曲線表現(xiàn)較為平滑，發(fā)酵時(shí)間與接種量比例之間的交互作用不顯著；酒精度隨發(fā)酵溫度及接菌量比例的升高呈先上升后下降的趨勢，發(fā)酵溫度及接菌量比例的交互作用顯著；隨著發(fā)酵溫度的升高，酒精度呈先上升后降低的趨勢，發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度的交互作用不顯著。

2.4 馬奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)

對馬奶酒酒精度取最大值，由軟件自動分析可得到馬奶酒最佳發(fā)酵條件理論值為：接菌量（乳酸菌/酵母菌）2.8%∶5.2%、發(fā)酵時(shí)間80.8h、發(fā)酵溫度31.68℃，所測酒精度為6.967 82%vol?？紤]實(shí)際操作方便，選取接菌量（乳酸菌%/酵母菌%）3%∶5%、發(fā)酵時(shí)間80h、發(fā)酵溫度32℃，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，馬奶酒的酒精度為7.0%vol、6.9%vol和7.0%vol，說明該數(shù)學(xué)模型的建立對馬奶酒酒精度的預(yù)測比較準(zhǔn)確。

2.5 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

2.5.1 感官指標(biāo)

外觀：酒體乳黃色，有少量蛋白沉淀；香氣：具有純正的乳香，淡淡的酒香；滋味：酒體醇厚，酒香柔和，酸甜協(xié)調(diào)，無異味；具有本品典型風(fēng)格。

2.5.2 理化指標(biāo)

酒精度3%vol～8%vol；總酸（以檸檬酸計(jì)）4～8g/L；還原糖（以葡萄糖計(jì)）40.1～70.0g/L。

2.5.3 微生物指標(biāo)菌落總數(shù)：1個(gè)/mL；大腸桿菌：1個(gè)/100mL；致病菌：未檢出。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面軟件，通過接菌量（乳酸菌：酵母菌）、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素，以馬奶酒酒精度為響應(yīng)值進(jìn)行模型建立和模型預(yù)測，得出馬奶酒最佳發(fā)酵條件分別為接種量（乳酸菌/酵母菌）3%∶5%，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間80h，糖添加量6%。在此條件下發(fā)酵的馬奶酒酒精度平均為7.0%vol，說明該數(shù)學(xué)模型對優(yōu)化馬奶酒發(fā)酵條件可行，并為馬奶酒工業(yè)化成產(chǎn)提供了依據(jù)，具有一定的實(shí)用意義。

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