響應(yīng)曲面法優(yōu)化浸提新疆紅樹莓中花色苷的工藝研究

陳其鋼，沈艾彬，陳國(guó)輝*

（新疆中亞食品研發(fā)中心（有限公司），新疆 烏魯木齊 830026）

紅樹莓（Rubus idaeus）是薔薇科懸鉤子屬植物，多年生小灌木漿果類果樹，樹莓果屬聚合果，形狀如寶石，果實(shí)鮮嫩多汁，口味酸甜，香味濃，可食率達(dá)100%[1]。其營(yíng)養(yǎng)豐富，維生素A達(dá)130 IU，是蘋果的13倍[2]；維生素C含量為26～40 mg/100 g，是蘋果、葡萄等果實(shí)的5～8倍[3]；還含有多種氨基酸、微量元素、花色苷、花青素以及兒茶酸等多酚類物質(zhì)[4]，紅樹莓鮮果的營(yíng)養(yǎng)成分見表1[5-8]。

新疆地處大陸中緯度，氣候溫和，熱量適中，空氣濕潤(rùn)，得天獨(dú)厚的山地氣候適宜樹莓的生長(zhǎng)[9]。紅樹莓中富含豐富的花色苷，是其主要的呈色物質(zhì)，隨著人類對(duì)健康飲食的重視以及科技的發(fā)展，對(duì)天然色素的需求量將日趨增加，劉建華等[10]研究表明，紅樹莓花色苷具有較強(qiáng)的清除自由基、抗腫瘤及降脂等多項(xiàng)功能。本研究以新疆南山水溪溝產(chǎn)紅樹莓為原料提取花色苷，在單因素研究的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0軟件優(yōu)化提取工藝，為新疆樹莓中花色苷的安全有效生產(chǎn)提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅樹莓：新疆烏魯木齊市南山水溪溝新康種植基地。

鹽酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的雙氧水、抗壞血酸、體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇、乙酸、三氯乙酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AB104-N電子天平：Mettle-Toledo公司；UV-2000紫外分光光度計(jì)：安捷倫科技有限公司；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樹莓花色苷的提取工藝流程

紅樹莓→研磨→水浴提取→過濾→真空濃縮→冷凍干燥→紅樹莓花色苷粗提取物

操作要點(diǎn)：新鮮紅樹莓在組織搗碎機(jī)破碎成漿，按一定料液比加入經(jīng)鹽酸酸化的體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液，在一定溫度的水浴中提取紅樹莓中花色苷，浸提液經(jīng)過40 ℃真空濃縮后，于-18 ℃條件下冷凍干燥，得到紅樹莓中花色苷粗提物。

1.3.2 樹莓花色苷含量的檢測(cè)方法

波長(zhǎng)的確定：將解凍后的紅樹莓研磨，準(zhǔn)確稱量5.0 g勻漿，加入40 mL經(jīng)鹽酸酸化體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液（pH 3），50 ℃水浴浸提1 h，過濾去除濾渣。在波長(zhǎng)400～800 nm范圍內(nèi)掃描，確定樹莓花色苷最大吸收波長(zhǎng)。

花色苷含量的計(jì)算根據(jù)比爾定律，結(jié)合FULEKI T等[11]的研究，得出花色苷含量計(jì)算公式：

式中：A0、A1分別為pH 1.0、pH 4.5時(shí)花色苷在波長(zhǎng)500 nm 處的吸光度值；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449；ε為Cy-3-Glu 的消光系數(shù)29 600；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 提取樹莓花色苷的單因素試驗(yàn)

料液比對(duì)樹莓花色苷提取量的影響：將解凍后的紅樹莓研磨，準(zhǔn)確稱量5.0 g勻漿，分別按1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g∶mL）加入經(jīng)鹽酸酸化的體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液（pH 3），50 ℃水浴浸提1 h，過濾去除濾渣。波長(zhǎng)500 nm處測(cè)其吸光度值，計(jì)算花色苷含量。

水浴溫度對(duì)樹莓花色苷提取量的影響：將解凍后的紅樹莓研磨，準(zhǔn)確稱量5.0 g勻漿，加入35 mL經(jīng)鹽酸酸化的體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液（pH 3），分別在40～60 ℃恒溫水浴浸提1 h，過濾去除濾渣。波長(zhǎng)500 nm處測(cè)其吸光度值，計(jì)算花色苷含量。

浸提時(shí)間對(duì)樹莓花色苷提取量的影響：將解凍后的紅樹莓研磨，準(zhǔn)確稱量5.0 g勻漿，加入35 mL經(jīng)鹽酸酸化的體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液（pH 3），50 ℃水浴分別浸提30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min過濾去除濾渣。波長(zhǎng)500 nm處測(cè)其吸光度值，計(jì)算花色苷含量。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以通過單因素試驗(yàn)確定響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的各因素水平，花色苷提取量（Y）為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

根據(jù)1.3.2的試驗(yàn)方法得到樹莓花色苷吸收波長(zhǎng)，結(jié)果見圖1。

圖1 紅樹莓花色苷吸收?qǐng)D譜Fig.1 The anthocyanins absorption spectrum of red raspberry

由圖1可知，紅樹莓花色苷的最大吸收波長(zhǎng)為500 nm，因此在后續(xù)試驗(yàn)中，采用在波長(zhǎng)500 nm處的吸光度值作為計(jì)算依據(jù)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 料液比對(duì)樹莓花色苷提取量的影響

紅樹莓樣品5.0 g，提取過程中控制體系溫度50 ℃、提取時(shí)間60 min，分別按1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g∶mL）料液比加入經(jīng)鹽酸酸化的體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液（pH 3），料液比對(duì)花色苷含量的影響結(jié)果見圖2。由圖2可見，料液比在1∶5～1∶7（g∶mL）范圍內(nèi)時(shí)，隨著料液比的增加，花色苷含量也隨之增加；料液比＞1∶7（g∶mL）時(shí)，花色苷含量開始減少。因此，確定提取紅樹莓花色苷的最佳料液比為1∶7（g∶mL）。

圖2 料液比對(duì)花色苷含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on anthocyanins content

2.2.2 水浴溫度對(duì)樹莓花色苷提取量的影響

紅樹莓樣品5.0 g，按料液比1∶7（g∶mL）加入經(jīng)鹽酸酸化的體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液（pH 3），提取時(shí)間60 min，分別選擇提取溫度40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃水浴提取，提取溫度對(duì)花色苷含量的影響結(jié)果見圖3。由圖3可見，隨著提取溫度的升高，體系中的花色苷含量并不是持續(xù)升高的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，花色苷含量達(dá)到峰值隨后又開始下降，為了避免樹莓中花色苷因溫度過高而分解，所以選擇提取溫度50 ℃為宜。

圖3 提取溫度對(duì)花色苷含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on anthocyanins content

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)樹莓花色苷提取量的影響

紅樹莓樣品5.0 g，按料液比1∶7（g∶mL）加入經(jīng)鹽酸酸化的體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液（pH 3），提取溫度50 ℃，設(shè)置提取時(shí)間分別為30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min。提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響結(jié)果見圖5。由圖4可知，提取時(shí)間對(duì)花色苷的提取較明顯，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在30～60 min內(nèi)，花色苷含量上升趨勢(shì)較明顯；而在60 min后開始緩慢下降，這可能是由于花色苷收到長(zhǎng)時(shí)間熱效應(yīng)的影響導(dǎo)致其分解[12]。所以，選擇提取時(shí)間為60 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on anthocyanins content

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.3.1 模型的建立與分析

依據(jù)方法1.3.4進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

利用Design Expert軟件對(duì)表3的花色苷含量進(jìn)行方差以及回歸分析，得到響應(yīng)值與各變量之間的回歸方程為：

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Results of response surface experiments

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)該數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析[13]，回歸方程方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，一次項(xiàng)中，A（料液比）、C（提取時(shí)間）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），B（提取溫度）影響不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)中A2、B2、C2的影響均顯著（P＜0.05）；經(jīng)方差分析可知模型P=0.002 5＜0.05，達(dá)到顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.069 6＞0.05未達(dá)到顯著水平，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，該模型能準(zhǔn)確的描述各變量因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[14-16]。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

2.3.2 響應(yīng)面的分析與優(yōu)化

通過模型方程得出的響應(yīng)曲面圖、等高線圖結(jié)果見圖5。由圖5可知，料液比、提取溫度兩因素間的交互作用明顯大于AC以及BC之間的交互作用。根據(jù)等高線的形狀可判斷交互作用的強(qiáng)弱[17]，橢圓形表示兩因素之間交互作用顯著，圓形表示則表示交互作用不顯著[18-21]。

圖5 料液比、提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)花色苷含量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line showing the effects of interactions of solid-liquid ratio,extraction temperature and extraction time on anthocyanins content

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝條件為料液比1∶7（g∶mL）、提取溫度50.93 ℃、提取時(shí)間64.73 min，此條件下得到的花色苷含量58.32 mg/100 g。實(shí)際操作過程中選擇料液比1∶7（g∶mL）、提取溫度51 ℃、提取時(shí)間65 min。

為了確保響應(yīng)面優(yōu)化條件的準(zhǔn)確性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，該條件下得到的花色苷含量為56.45 mg/100 g，相對(duì)誤差為3.2%，說(shuō)明通過響應(yīng)曲面法得到的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有可行性。

3 結(jié)論

從新疆樹莓中提取花色苷工藝的單因素和響應(yīng)曲面法分析，得到了該試驗(yàn)的最佳提取工藝條件為料液比1∶7（g∶mL）、提取溫度51 ℃、提取時(shí)間65 min，該條件下得到的花色苷含量為56.45 mg/100 g。該研究為新疆樹莓中花色苷的安全有效生產(chǎn)提供理論和技術(shù)依據(jù)。

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