響應(yīng)面分析法優(yōu)化雨生紅球藻產(chǎn)蝦青素培養(yǎng)基

徐建春，孫 翰，張睿欽，管 斌 *，孔 青，耿兆艷，李 霞

（1.青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司，山東青島，266400；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266003）

蝦青素（astaxanthin，AX）是一種酮式類胡蘿卜素[1]，化學(xué)名稱為3,3’-二羥基-4,4’-二酮基-β,β’-胡蘿卜素，分子式為C40H52O4。蝦青素具有極強(qiáng)的抗氧化活性，極易與自由基反應(yīng)而清除自由基[2-5]，其抗氧化性是β-胡蘿卜素的10倍，維生素E的500倍[6]，被譽(yù)為超級(jí)維生素。其在食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖及醫(yī)藥方面有著廣泛的應(yīng)用前景[7-9]。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是蝦青素的良好來源[10]，而且雨生紅球藻所含蝦青素是3S-3’S異構(gòu)體，與水生動(dòng)物所含蝦青素極為相似，易被生物體吸收[11]，雨生紅球藻被認(rèn)為是自然界積累天然蝦青素能力最強(qiáng)的生物。這是通過化學(xué)合成以及利用紅發(fā)夫酵母發(fā)酵的蝦青素所不具備的優(yōu)勢(shì)[12]。

培養(yǎng)基質(zhì)是雨生紅球藻生長和蝦青素積累的重要因子，是影響雨生紅球藻培養(yǎng)及蝦青素?cái)U(kuò)大工業(yè)化生產(chǎn)的要素[13-14]。本研究采用響應(yīng)面分析法，對(duì)雨生紅球藻混合培養(yǎng)過程中的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的碳源、氮源和磷源進(jìn)行優(yōu)化，以獲得更大的生物濃度和蝦青素產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻種

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）誘變菌株：中國海洋大學(xué)生物工藝學(xué)研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

微藻培養(yǎng)基為改良的MCM培養(yǎng)基：葡萄糖3 g/L，KNO30.5 g/L，KH2PO40.02 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.08 g/L，F(xiàn)e-EDTA 100 μL/L，微量元素100 μL/L，pH值調(diào)至8.0。

Fe-ED TA 溶 液：EDTA·2Na 3.72 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.17g/L。

微量元素母液：H3PO412.37 mg/L，ZnSO471.89 mg/L，MnSO4·H2O 84.51 mg/L，CuSO4·5H2O62.42mg/L，Na2MoO4·2H2O 7.26 mg/L，CoCl2·2H2O4.76 mg/L。

微藻的生長培養(yǎng)基中加入1.6 g/L NaAc或者葡萄糖3 g/L，其余成分與藻種培養(yǎng)基相同，pH調(diào)至8.0。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：乙酸鈉1.5.g/L，KNO30.5 g/L，KH2PO40.02 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.08 g/L，F(xiàn)e-EDTA 100 μL/L，微量元素100 μL/L，pH值調(diào)至8.0。

試驗(yàn)所用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

QHX-250BS-Ⅲ人工氣候箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SPS202F電子天平：梅特勒-托利多（常州）設(shè)備有限公司；PHS-2F數(shù)字pH計(jì)：上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司；722N可見分光光度計(jì)：上海精科儀器有限公司；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞破碎器：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2802PC紫外分光光度計(jì)：尤尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基主要成分對(duì)蝦青素積累的影響

（1）碳源對(duì)蝦青素積累的影響

本研究為培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化基質(zhì)提供了乙酸鈉和葡萄糖兩種碳源，并對(duì)比選擇最優(yōu)轉(zhuǎn)化碳源。固定氮源為0.01 g/L KNO3，磷源為0.01 g/L KH2PO4，設(shè)置乙酸鈉質(zhì)量濃度分別為0.2 g/L、0.5 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度分別設(shè)置為2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L，培養(yǎng)7 d后，然后將微藻液分別裝入50 mL離心管，5 000 r/min離心10 min，除去上清液，將微藻細(xì)胞分別轉(zhuǎn)接入裝有不同乙酸鈉和葡萄糖的培養(yǎng)基（每份50 mL）中進(jìn)行藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，將在原培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化的組別作為對(duì)照組，測(cè)定不同碳源對(duì)蝦青素含量的影響。

（2）KNO3的含量對(duì)蝦青素積累的影響

在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中固定碳源為0.5 g/L 乙酸鈉，磷源為0.01 g/L KH2PO4，設(shè)置KNO3質(zhì)量濃度分別為0、0.005 g/L、0.01 g/L、0.04 g/L、0.07 g/L、0.10 g/L。培養(yǎng)基其余成分及其他試驗(yàn)條件不變。雨生紅球藻在生長條件下，培養(yǎng)7 d后，然后將培養(yǎng)藻液分別在5 000 r/min條件下離心10 min，除去上清液，將藻細(xì)胞分別轉(zhuǎn)接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中進(jìn)行藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，測(cè)定蝦青素含量。

（3）KH2PO4含量對(duì)蝦青素積累的影響

在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中固定碳源為0.5 g/L 乙酸鈉，氮源為0.01g/LKNO3，設(shè)置KH2PO4質(zhì)量濃度分別為0、0.01g/L、0.1g/L、0.2 g/L、0.3 g/L。培養(yǎng)基其余成分含量不變。其他試驗(yàn)條件不變。雨生紅球藻在生長條件下，培養(yǎng)7 d后，然后將培養(yǎng)藻液分別在5 000 r/min條件下離心10 min，除去上清液，將藻細(xì)胞分別轉(zhuǎn)接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中進(jìn)行藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，測(cè)定蝦青素含量。

1.3.2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）優(yōu)化轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

雨生紅球藻在生長條件下，培養(yǎng)7 d后，然后將培養(yǎng)藻液分別在5 000 r/min條件下離心10 min，除去上清液，將藻細(xì)胞分別轉(zhuǎn)接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中進(jìn)行藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，測(cè)定蝦青素含量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)二因素三水平的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）優(yōu)化培養(yǎng)基成分。選取乙酸鈉、KNO3添加量兩個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 雨生紅球藻轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基優(yōu)化CCD試試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factor and levels of central composite design for transformation medium optimization

1.3.3 微藻細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化方法及指標(biāo)測(cè)定

培養(yǎng)方法：以10%的接種量將藻種接入100 mL培養(yǎng)液中，22 ℃，光照1 000～1 500 lx，光周期12∶12（光照培養(yǎng)時(shí)間12 h∶暗培養(yǎng)時(shí)間12 h），培養(yǎng)7 d。轉(zhuǎn)化方法：30 ℃，光照強(qiáng)度5 000～5 500 lx，全天光照，轉(zhuǎn)化5 d。

細(xì)胞密度的測(cè)定：利用722N可見分光光度計(jì)測(cè)定680 nm波長處的吸光度值。

細(xì)胞形態(tài)的觀察：顯微鏡放大160倍進(jìn)行觀察。

蝦青素含量的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[15]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。移取5 mL孢子態(tài)的藻體，4 000 r/mim離心10 min，除上清，收集藻體，加入2 mL甲醇/KOH溶液（30%甲醇和5%KOH等體積混合液）振蕩，使藻體均勻分散后置于65 ℃恒溫水浴中加熱15 min，4 000 r/min離心15 min，去除上清液，沉淀加蒸餾水洗滌2次，去除殘留堿液。上述藻體加入5 mL二甲基亞砜，200 W超聲波破碎10 min，離心收集上清液，沉淀加入二甲基亞砜重復(fù)提取，直至藻體沉淀變白，40 ℃振蕩提取20 min，紅色上清液于波長490 nm條件下測(cè)定吸光度值。

式中：C為蝦青素含量，mg/L；OD490為波長490 nm條件下的吸光度值；Va為提取液體積，mL；Vb為藻液體積，mL；f1為測(cè)吸光度值時(shí)的稀釋倍數(shù)；f2為轉(zhuǎn)化過程中水蒸發(fā)帶來的濃縮倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)蝦青素積累的影響

（1）乙酸鈉含量對(duì)蝦青素積累的影響

雨生紅球藻細(xì)胞在一定培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)化條件下，不同乙酸鈉濃度對(duì)蝦青素積累的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙酸鈉含量對(duì)蝦青素生成量的影響Fig.1 Effect of sodium acetate content on astaxanthin production

由圖1可值，當(dāng)乙酸鈉含量＜1.5 g/L范圍內(nèi)，蝦青素含量隨乙酸鈉含量增加而增加；當(dāng)乙酸鈉含量為1.5 g/L時(shí)，蝦青素含量達(dá)到最高（10.25 mg/L），是對(duì)照的10.48倍；當(dāng)乙酸鈉含量＞1.5 g/L，蝦青素含量隨乙酸鈉含量增加而減少。利用乙酸鈉進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)可顯著促進(jìn)蝦青素生物轉(zhuǎn)化。

（2）葡萄糖含量對(duì)蝦青素積累的影響

雨生紅球藻細(xì)胞在一定培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)化條件下，不同葡萄糖含量對(duì)蝦青素積累的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 葡萄糖含量對(duì)蝦青素生成量的影響Fig.2 Effect of glucose content on astaxanthin production

由圖2可看知，隨著葡萄糖含量增加，蝦青素含量減少；當(dāng)葡萄糖含量為2.0 g/L時(shí)，蝦青素含量達(dá)到較高水平（2.94 mg/L）。與對(duì)照相比，蝦青素含量增加較多（是對(duì)照的3.01倍）。利用葡萄糖進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)可促進(jìn)蝦青素生物轉(zhuǎn)化。

由圖1與圖2對(duì)比分析可看出，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中以乙酸鈉作碳源，比以葡萄糖作碳源時(shí)蝦青素含量高（以乙酸鈉作碳源時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)蝦青素含量為10.25 mg/L；以葡萄糖作碳源時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)蝦青素含量為2.94 mg/L）。利用乙酸鈉作為碳源與葡萄糖相比，異養(yǎng)培養(yǎng)過程對(duì)蝦青素生物轉(zhuǎn)化作用更加顯著。

2.2 KNO3含量對(duì)蝦青素積累的影響

雨生紅球藻細(xì)胞在一定培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)化條件下，不同KNO3含量對(duì)蝦青素積累的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 硝酸鉀含量對(duì)蝦青素生成量的影響Fig.3 Effect of potassium nitrate content on astaxanthin production

由圖3可知，當(dāng)KNO3含量＜0.01 g/L范圍內(nèi)，蝦青素含量增加；當(dāng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中硝酸鉀含量為0.01 g/L時(shí)，蝦青素含量最高（12.09 mg/L），是對(duì)照中的蝦青素含量的12.37倍，后隨硝酸鉀含量的增加蝦青素含量快速下降。這個(gè)結(jié)果與BOROWITZKA M A等[16]的結(jié)論一致，在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基質(zhì)中氮源相對(duì)缺乏時(shí)可促進(jìn)蝦青素生物轉(zhuǎn)化。

2.3 KH2PO4含量對(duì)蝦青素積累的影響

雨生紅球藻細(xì)胞在一定培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)化條件下，不同KH2PO4含量對(duì)蝦青素積累的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 磷酸二氫鉀含量對(duì)蝦青素量生成的影響Fig.4 Effect of potassium dihydrogen phosphate content on astaxanthin production

由圖4可知，當(dāng)KH2PO4含量在0～0.3 g/L范圍內(nèi)，磷含量對(duì)蝦青素影響并不大，且磷酸二氫鉀含量＞0.1 g/L時(shí)培養(yǎng)基中開始出現(xiàn)白色渾濁（磷酸根與其他金屬離子相結(jié)合產(chǎn)生白色渾濁），所以在后面響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)中只考慮硝酸鉀和乙酸鈉含量，而磷含量保持不變，即0.01 g/L。

2.4 響應(yīng)面試試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法確定轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中NaAc含量（X1）和KNO3含量（X2），以蝦青素含量的平均值為響應(yīng)值Y。中心組合試試驗(yàn)結(jié)果、方差分析分別如表2、表3所示。

對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析獲得如下的回歸方程：

表2 雨生紅球藻轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基優(yōu)化CCD試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of CCD experiment for transformation medium optimization

為考察影響雨生血球藻轉(zhuǎn)化程度及試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了方差分析，如表3所示。由表3可知，該方程對(duì)蝦青素含量的決定系數(shù)（R2）為0.794 0，這表明總變量中有79.4%的變量符合該模型。在考察的兩個(gè)因素中，乙酸鈉含量和KNO3含量對(duì)雨生血球藻轉(zhuǎn)化生成蝦青素具有顯著影響。

表3 雨生紅球藻轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基優(yōu)化CCD試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of CCD experiment for transformation medium optimization

為了進(jìn)一步說明乙酸鈉和硝酸鉀含量的交互作用和決定兩個(gè)因素的水平對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果利用Statistica 7.1獲得了三維響應(yīng)面曲線，如圖5所示。

圖5 乙酸鈉和硝酸鉀含量對(duì)蝦青素生成量影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plots of effects of interaction between sodium acetate content and nitrate content on astaxanthin production

由圖5可看出，在乙酸鈉含量在1.460 5 g/L，硝酸鉀含量在0.008 4 g/L時(shí)，蝦青素含量達(dá)到了最高值11.046 0 mg/L。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在中心組合試驗(yàn)得出的最優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，所得蝦青素含量為10.908 mg/L，與預(yù)測(cè)值擬合較好，說明模型能較好地預(yù)測(cè)蝦青素含量。

3 結(jié)論

通過本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)雨生紅球藻轉(zhuǎn)化產(chǎn)蝦青素影響較大的是硝酸鉀含量、乙酸鈉含量，而磷酸二氫鉀的含量對(duì)蝦青素產(chǎn)量影響不大。通過中心組合試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中乙酸鈉含量為1.460 5 g/L，硝酸鉀含量為0.008 4 g/L，磷酸二氫鉀0.01 g/L，通過對(duì)預(yù)測(cè)模型的反復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，蝦青素產(chǎn)量為10.908 mg/L，與模型預(yù)測(cè)值基本一致，使得蝦青素產(chǎn)量比對(duì)照培養(yǎng)基提高了9.16倍。

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