甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺標(biāo)本中BRAFV600E突變的臨床意義

馬麗珍 俞靈鶯 屠巧峰 余道軍 張祎 方建華

甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺標(biāo)本中BRAFV600E突變的臨床意義

馬麗珍 俞靈鶯 屠巧峰 余道軍 張祎 方建華

目的 探討B(tài)RAFV600E突變率在甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前診斷中的意義及其可行性。方法選擇2012-01—2013-01行細(xì)針穿刺術(shù)（FNA）的甲狀腺結(jié)節(jié)患者337例，根據(jù)細(xì)胞學(xué)診斷分為Thy1、Thy2、Thy4和Thy5組，分別檢測FNA標(biāo)本的BRAFV600E突變。結(jié)果Thy5組BRAFV600E突變率為22．2%；甲狀腺結(jié)節(jié)的不同病理類型及BRAF突變率與橋本甲狀腺炎（HT）無相關(guān)性（均P＞0．05）；與Thy2組比，Thy5組TSH水平較高[（2．83±2．11 vs 1．95±1．29）mU/L，t=2．251，P＜0．05]。結(jié)論檢測甲狀腺結(jié)節(jié)FNA標(biāo)本的BRAFV600E突變簡便、可行；對一部分因取材不滿意標(biāo)本可提供補(bǔ)充診斷；BRAF突變與HT可能無關(guān)。

BRAF突變 細(xì)針穿刺 甲狀腺乳頭狀癌

甲狀腺結(jié)節(jié)是內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，觸診的陽性率為3.0%～7.0%，高分辨率B超檢查的陽性率為20.0%～76.0%，其中甲狀腺癌的患病率為5.0%～15.0%。細(xì)針穿刺（fine needle aspiration，F(xiàn)NA）細(xì)胞學(xué)檢查的術(shù)前診斷敏感性和特異性分別達(dá)到83.0%和92.0%，但是FNA檢查的一個重要缺陷是部分結(jié)節(jié)因取材問題導(dǎo)致無法診斷或診斷不滿意，而這部分結(jié)節(jié)中約1.0%～4.0%可能為惡性[1]。目前研究證實，對穿刺標(biāo)本進(jìn)行分子標(biāo)記物檢測能夠提高確診率，其中BRAF基因突變研究最深入，但目前國內(nèi)臨床開展甲狀腺FNA標(biāo)本的分子標(biāo)記物檢測的研究報道較少，且樣本量不大。本研究用基因測序法檢測甲狀腺FNA標(biāo)本BRAFV600E突變，分析BRAF突變與患者臨床病理特征的關(guān)系，以期為甲狀腺結(jié)節(jié)個體化分子診治提供參考。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇2012-01—2013-01于本院內(nèi)分泌科就診并行甲狀腺結(jié)節(jié)FNA檢查的337例患者，共349枚結(jié)節(jié)。其中男58例共59結(jié)節(jié)，女279例共290結(jié)節(jié)，男：女=1：4.81；年齡16～91歲，平均（48.9±13.0）歲。橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）的診斷依據(jù)：甲狀腺腫大伴抗甲狀腺抗體（Tg-Ab、TPO-Ab）升高＞50%，或經(jīng)病理學(xué)證實。FNA標(biāo)本病理學(xué)結(jié)果判定依據(jù)我國《甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》[1]，分為取材無法診斷或不滿意（Thy1）結(jié)節(jié)47枚、良性（Thy2）結(jié)節(jié)203枚、可疑惡性（Thy4）結(jié)節(jié)6枚和惡性（Thy5）結(jié)節(jié)28枚。其中診斷不確定（Thy3）的65枚結(jié)節(jié)由于標(biāo)本缺失等原因，未納入統(tǒng)計，故本研究中最終納入284枚結(jié)節(jié)。

1.2 儀器和試劑 高分辨率彩色多普勒超聲診斷儀購于意大利Etaso公司，Multi-Image凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司，2720 Thermal Cycler PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。DNA提取試劑盒、PCR試劑盒為大連寶生物有限公司產(chǎn)品。引物合成于上海輝睿生物科技有限公司，DNA測序由上海英淮維基生物科技有限公司完成。根據(jù)BRAF基因組DNA序列設(shè)計引物，用以擴(kuò)增BRAF第15號外顯子包含突變熱點V600E的DNA序列。BRAFV600E上游引物5′-ACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCT-3′，下游引物5′-CTGATTTTTGTGAATACTGGGAACT-3′；內(nèi)參基因β-actin上游引物5′-GGATGCAGAAGGAGATCACTG-3′，下游引物5′-CGATCCACACGGAGTACTTG-3′。

1.3 超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)FNA 術(shù)前常規(guī)檢查出、凝血時間及血小板計數(shù)，向患者解釋穿刺過程并簽署知情同意書?；颊呷∑脚P位，頸后墊一枕墊以充分暴露穿刺部位。彩色多普勒超聲診斷儀采用6～10MHz線陣探頭，探查甲狀腺左右側(cè)葉及峽部。選擇適當(dāng)?shù)拇┐厅c和穿刺途徑，常規(guī)消毒鋪巾，在探頭上套無菌套，采用21G/23G針頭，穿刺進(jìn)入結(jié)節(jié)后來回移動并旋轉(zhuǎn)或連接5ml注射器抽吸，一般進(jìn)針2～3次，標(biāo)本常規(guī)涂片2～4張，風(fēng)干后95%乙醇固定并行HE染色，用于病理學(xué)診斷。同時留取細(xì)胞標(biāo)本-80℃冰箱保存用于基因檢測。

1.4 分子生物學(xué)檢測 取凍存的FNA標(biāo)本，依據(jù)試劑盒說明書提取細(xì)胞基因組DNA。依次加入10×Buffer 5μl、dNTP4μl、上下游引物各1μl、TaqDNA聚合酶0.25μl、DNA 5μl、dH2O 32.75μl，構(gòu)建50μl PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃變性5min，95℃ 30s，52℃退火45s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物行凝膠電泳，以DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品作為陽性對照。電泳結(jié)束后，通過紫外透視儀觀察、拍照。篩選出的病例繼續(xù)擴(kuò)增BRAF基因15外顯子。PCR產(chǎn)物送檢DNA測序，將測序結(jié)果與BRAF基因組DNA序列進(jìn)行比對，以確定有無點突變。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組樣本比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺標(biāo)本PCR產(chǎn)物電泳及測序結(jié)果 凝膠電泳顯示，從細(xì)胞樣本提取的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品對照具備可比性，圖1中1號條帶為陽性。經(jīng)測序證實為15號外顯子上第1 799位核苷酸T→A的轉(zhuǎn)換，即密碼子600位的錯義突變（V600E），見圖2。

圖1 FNA標(biāo)本PCR產(chǎn)物電泳（5、6之間為DNA陽性對照，N為陰性對照，1為陽性）

圖2 FNA標(biāo)本BRAFV600E突變測序結(jié)果（A：15號外顯子上第1 799位核苷酸T→A的轉(zhuǎn)換；B：陰性對照）

2.2 各組患者甲狀腺結(jié)節(jié)BRAF突變率及甲狀腺功能比較 284枚甲狀腺結(jié)節(jié)FNA標(biāo)本完成基因測序，其中87.0%滿足基因診斷。各組標(biāo)本中因DNA量不足而不能完成基因診斷的依次為：Thy1組12.8%（6/47），Thy2組13.8%（28/203），Thy4組33.3%（2/6）和Thy5組3.6%（1/28）。BRAFV600E突變率為4.8%（12/247），其中Thy5組（22.2%，6/27），與Thy2組（3.4%，7/203）比較，有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=14.786，P＜0.01）。Thy5組6枚突變陽性結(jié)節(jié)均經(jīng)術(shù)后組織學(xué)確診為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）。不同病理類型甲狀腺結(jié)節(jié)與HT間均無相關(guān)性（均P＞0.05）。甲狀腺功能比較，Thy5組TSH水平較Thy2組高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（t=-2.251，P＜0.05），其余組間比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），見表1。

2.3 各組患者甲狀腺結(jié)節(jié)BRAF突變與HT相關(guān)性 各組患者BRAFV600E突變與HT總體無相關(guān)性（χ2=2.959，P＞0.05）。進(jìn)一步分層比較提示Thy2組和Thy5組BRAFV600E突變與HT均無相關(guān)性（χ2=1.165、0.044，均P＞0.05），見表2。Thy1組及Thy4組樣本量少，未作統(tǒng)計學(xué)處理。

3 討論

由于50.0%以上惡性甲狀腺結(jié)節(jié)無癥狀，當(dāng)出現(xiàn)癥狀和體征時診斷常常為時已晚。如果結(jié)節(jié)質(zhì)地較硬，與周圍粘連、生長迅速，伴周圍淋巴結(jié)腫大，聲帶麻痹，或侵犯頸部組織等表現(xiàn)時惡性風(fēng)險增加7倍。指南推薦當(dāng)出現(xiàn)上述2項或2項以上臨床表現(xiàn)，包括具有甲狀腺癌家族史，常可臨床診斷為甲狀腺癌，但這種情況較少見[1]。目前臨床上主要依靠超聲診斷，超聲結(jié)合FNA細(xì)胞學(xué)診斷是術(shù)前最可靠的手段。FNA診斷敏感性高，但仍然可能存在假陰性，而且部分結(jié)節(jié)因取材問題導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)無法診斷。檢測BRAF突變有助于鑒別這些不確定標(biāo)本，提高術(shù)前診斷準(zhǔn)確率。本研究甲狀腺結(jié)節(jié)FNA標(biāo)本87.0%（247/284）完成BRAF突變基因診斷，基本滿足臨床診斷的要求。值得注意的是，47枚細(xì)胞學(xué)不能診斷或結(jié)節(jié)取材不滿意的Thy1組患者結(jié)節(jié)中，87.2%完成基因診斷，提示FNA標(biāo)本DNA檢測可以提供補(bǔ)充診斷。隨著經(jīng)驗積累，標(biāo)本取材滿意率提高，有望進(jìn)一步提高診斷陽性率。

表1 各組患者甲狀腺標(biāo)本BRAFV600E突變及甲狀腺功能比較

表2 不同病理類型甲狀腺結(jié)節(jié)HT與BRAFV600E突變率比較[例（%）]

BRAF基因位于染色體7q34，全長約190kb，轉(zhuǎn)錄mRNA長約2.4kb，編碼的BRAF蛋白是一個95kD左右的絲/蘇氨酸激酶，作為RAS下游效應(yīng)器，在MARK信號通路中發(fā)揮重要作用。目前已證實至少45種BRAF突變，90%是15號外顯子1 799位核苷酸T→A轉(zhuǎn)位（T1 799A），導(dǎo)致600位纈氨酸被谷氨酸替代，稱V600E[2]。檢測術(shù)前穿刺標(biāo)本的BRAF突變狀況，有助于選擇最佳手術(shù)方式，也可為術(shù)后復(fù)發(fā)的臨床監(jiān)測提供可靠的參考，在治療方面也很有意義。Fagin等[3]的研究中應(yīng)用Raf激酶抑制劑已起到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

據(jù)目前文獻(xiàn)報道，BRAFV600E突變僅見于甲狀腺惡性腫瘤，主要見于經(jīng)典的PTC，在高細(xì)胞變異的PTC及PTC來源的低分化癌、未分化癌也有報道，但在濾泡狀變異的PTC（FVPTC）中極少，在甲狀腺濾泡癌則未見報道[2]。彌漫硬化變異型PTC[4]、PTC罕見變異型（cribri-form-morular variant of PTC,CMVPTC）也未檢測到BRAF突變[5]。理論上BRAF突變聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查可以提高診斷陽性率，目前有關(guān)方法學(xué)可行性驗證主要見于國外文獻(xiàn)[6]，國內(nèi)未見報道。不同地區(qū)報道的BRAF突變率不一致，在60.0%左右。本研究細(xì)胞學(xué)診斷為惡性的結(jié)節(jié)中，BRAFV600E突變率為22.2%，突變陽性者均經(jīng)術(shù)后組織病理證實為PTC。另有6枚細(xì)胞學(xué)診斷良性的結(jié)節(jié)查見突變，很可惜其中3例患者分別因妊娠、兩次FNA檢查提示細(xì)胞學(xué)形態(tài)良性以及準(zhǔn)備生育而拒絕手術(shù)，另外3例因預(yù)留電話號碼不準(zhǔn)確而失訪，其臨床結(jié)局有待隨訪手術(shù)后組織病理學(xué)診斷進(jìn)一步明確。

對于HT與PTC相關(guān)性目前尚存在爭議，有人認(rèn)為HT是甲狀腺癌的一種癌前病變，但對于HT在甲狀腺發(fā)病機(jī)制中的作用目前尚不清楚，是否參與MARK途徑也不明確。在本研究中，不同細(xì)胞學(xué)病理類型合并HT的組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異，因此尚不能推斷HT與PTC中BRAF突變的相關(guān)性。

Kim等[7]研究發(fā)現(xiàn)高TSH與分化型甲狀腺癌風(fēng)險增加及PTC不良預(yù)后相關(guān)。對TSH正?；蛏叩幕颊撸缬谐?、病史危險因素應(yīng)行FNA。如果超聲顯示淋巴結(jié)可疑，也應(yīng)行淋巴結(jié)穿刺，本研究結(jié)果與上述結(jié)論具有一致性，不同病理類型組間TSH水平有統(tǒng)計學(xué)差異。文獻(xiàn)顯示，BRAFV600E突變的甲狀腺癌患者與預(yù)后不佳相關(guān)，存在較高的侵襲性[8-9]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險[10]，對131I治療的抵抗率也較高[11-13]，給臨床術(shù)后進(jìn)一步診治帶來難度，對這類患者需早期診斷，早期治療，密切隨訪。此外，通過干預(yù)MARK通路的靶向藥物治療甲狀腺癌的研究也逐漸從基礎(chǔ)走向臨床[14]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)臨床開展術(shù)前FNA獲得BRAF突變的個體化診斷具備可行性，特別是對于取材不滿意的標(biāo)本行基因診斷可進(jìn)一步診斷，從而減少重復(fù)穿刺，提高診斷效率。此外，基于BRAF突變與不良預(yù)后結(jié)局相關(guān)，基因診斷有助于指導(dǎo)手術(shù)方案和術(shù)后隨訪方案，并且可以為腫瘤靶向治療提供依據(jù)。

[1]中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會．甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南[J]．中華內(nèi)分泌代謝雜志,2012,28(10)：779-797．

[2]Tang K T,Lee C H．BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma：pathogenic role and clinical implications[J]．J Chin Med Assoc, 2010,73(3)：113-128．

[3]Fagin J A,Mitsiades N．Molecular pathology of thyroid cancer：diagnostic and clinical implications[J]．Best Pract Res Clin Endocrinol Metab,2008,22(6)：955-969．

[4]Sheu S Y,Schwertheim S,Worm K,et al．Diffuse sclerosing variant of papillary thyroid carcinoma：lack of BRAF mutation but occurrence of RET/PTC rearrangements[J]．Mod Pathol,2007,20(7)：779-787．

[5]Schuetze D,Hoschar A P,Seethala R R,et al．The T1799A BRAF mutation is absent in cribriform-morular variant of papillary carcinoma[J]．Arch Pathol Lab Med,2009,133(5)：803-805．

[6] Pelizzo M R,Boschin I M,Barollo S,et,al．BRAF analysis by fine needle aspiration biopsy of thyroid nodules improves preoperative identification of papillary thyroid carcinoma and represents a prognostic factor．A mono-institutional experience[J]．Clin Chem Lab Med,2011,49(2)：325-329．

[7] Kim D,Park J W．Clinical implications of preoperative thyrotropin serum concentrations in patients who underwent thyroidectomy for nonfunctioning nodule(s)[J]．J Korean Surg Soc,2013,85(1)：15-19．

[8] Mesa J C,Mirza M,Mitsutake N,et al．Conditional activation of RET/PTC3 and BRAFV600E in thyroid cells is associated with gene expression profiles that predict a preferential role of BRAF in extracellular matrix remodeling[J]．Cancer Res,2006,66(13)：6521-6529．

[9]Durand S,Ferraro-Peyret C,Joufre M,et al．Molecular characteristics of papillary thyroid carcinomas without BRAF mutation or RET/PTC rearrangement：relationship with clinico-pathological features[J]．Endocr Relat Cancer,2009,16(2)：467-481．

[10]Rivera M,Ricarte-Filho J,Knauf J,et al．Molecular genotyping of papillary thyroid carcinoma follicular variant according to its histological subtypes (encapsulated vs infiltrative)reveals distinct BRAF and RAS mutation patterns[J]．Mod Pathol,2010,23(9)：1191-1200．

[11] Romei C,Ciampi R,Faviana P,et al．BRAFV600E mutation,but not RET/PTC rearrangements,is correlated with a lower expression of both thyroperoxidase and sodium iodide symporter genes in papillary thyroid cancer[J]．Endocr Relat Cancer,2008, 15(2)：511-520．

[12]Porra V,Ferraro P C,Durand C,et al．Silencing of the tumor suppressor gene SLC5A8 is associated with BRAF mutations in classical papillary thyroid carcinomas[J]．J Clin Endocrinol Metab, 2005,90(5)：3028-3035．

[13] Mian C,Barollo S,Pennelli G,et al．Molecular characteristics in papillary thyroid cancers(PTCs)with no 131I uptake[J]．Clin Endocrinol(Oxf),2008,68(1)：108-116．

[14] Takami H E．Current status of molecularly targeted drugs for the treatment of advanced thyroid cancer[J]．Endocr J,2011,58(3)：151-153．

Detection of BRAFV600Emutation in fine needle aspiration specimens of thyroid nodules and its clinical implication

Objective To investigate BRAFV600Emutation in fine needle aspiration (FNA)specimens of thyroid nodules and its clinical implication．MethodsTotal 349 FNA samples were collected from patents with thyroid nodules in our hospital during January 2012 to January 2013．Based on cytological findings thyroid nodules were classified as Thy1,Thy2,Th3,Thy4 and Thy5 groups．BRAFV600Emutation was detected by sequence．ResultsThe prevalence of the BRAFV600Emutation in FNA samples of group Thy5 was 22．2%,and the results implied no associations between BRAFV600Emutation and Hashimoto′s thyroiditis(HT)．Compared to Thy2,there were higher level of TSH in group Thy5[(2．83±2．11vs1．95±1．29)mU/L,t=2．251,P＜0．05]．ConclusionDetection of BRAFV600Emutation in FNA samples before surgery is of use in diagnosis of thyroid nodules．The results of this study imply that there is no significant relation between BRAFV600Emutation and Hashimoto's thyroiditis．

BRAF mutation Fine needle aspiration Papillary thyroid carcinoma

2013-10-28）

（本文編輯：胥昀）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2010KYA161）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（馬麗珍、俞靈鶯、張祎），檢驗科（屠巧峰、余道軍），超聲影像科（方建華）

俞靈鶯，E-mail:yudada@live.cn