新興污染物BP-3和BP-4的好氧生物降解性能

張 弘，殷浩文，周忠良，陳曉倩，劉 敏

（1. 華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062；2. 上海市檢測中心 生物與安全實驗室，上海 201203）

新興污染物BP-3和BP-4的好氧生物降解性能

張 弘1，殷浩文2，周忠良1，陳曉倩2，劉 敏2

（1. 華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062；2. 上海市檢測中心 生物與安全實驗室，上海 201203）

［摘要］采用歐洲經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）的生物降解測試標準方法——301F測壓呼吸計量法，考察了2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮（BP-3）和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸（BP-4）的好氧生物降解性能，并研究了降解動力學(xué)及共代謝現(xiàn)象。實驗結(jié)果表明：BP-3和BP-4的可生物降解率分別為68.36%和41.34%；根據(jù)OECD快速降解性判定標準，BP-3劃歸為易快速降解物質(zhì)，而BP-4為不易快速降解物質(zhì)；兩種物質(zhì)的生物降解可用一級動力學(xué)描述，半衰期分別為1.986 d和2.806 d；根據(jù)歐盟法規(guī)《化學(xué)品的注冊、評估、授權(quán)和限制》（REACH法規(guī)），BP-3和BP-4均非持久性物質(zhì)；與苯甲酸鈉共存時，BP-3和BP-4的降解過程均表現(xiàn)出共代謝現(xiàn)象。

［關(guān)鍵詞］2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮；2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸；好氧生物降解；301F測壓呼吸計量法；半衰期；共代謝

2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮（BP-3）和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸（BP-4）是兩種生產(chǎn)量較大［1-2］、使用較多的二苯甲酮類紫外線吸收劑［3］，常用于生產(chǎn)化妝品、沐浴露、洗發(fā)露等個人護理用品，能有效防止紫外線對人體的傷害［4］。隨著人們的廣泛使用，BP-3和BP-4被大量釋放到水環(huán)境中［5］。近年來，中國、瑞士、美國等很多國家在污水等環(huán)境介質(zhì)中檢測出這兩種物質(zhì)［6-8］。環(huán)境中檢出的紫外吸收劑與藥品統(tǒng)稱為PPCPs類新興污染物。相關(guān)的研究結(jié)果表明，作為PPCPs類的BP-3和BP-4對生物體具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)及生殖毒性［9-11］。

微生物降解作用是自然界中有機物最終礦化的唯一途徑［12］，是決定有機污染物環(huán)境歸宿的關(guān)鍵。研究BP-3和BP-4的生物降解有助于深入了解它們的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，不僅為控制污染、保護環(huán)境提供理論依據(jù)，還可為研制環(huán)境友好型防曬劑提供參考，同時也有助于為有效處理含防曬劑的有機廢水提供思路。截至目前，國內(nèi)未見有關(guān)BP-3和BP-4生物降解的報道。

本工作采用歐洲經(jīng)濟合作發(fā)展組織（OECD）提出的生物降解測試標準方法—301F測壓呼吸計量法（OECD-301F 法）［13］研究BP-3和BP-4的好氧生物降解性能，并考察其降解動力學(xué)以及共代謝現(xiàn)象。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料和儀器

BP-3：純度為99%； BP-4：純度為97%；苯甲酸鈉：純度為98%；甲醇：分析純；乙腈：分析純；四氫呋喃：分析純。

接種物：采自上海某城市污水處理廠曝氣池的新鮮活性污泥。

BP-3溶液：BP-3質(zhì)量濃度為0.030～0.225 mg/L的甲醇溶液；BP-4溶液：BP-4質(zhì)量濃度為0.052～0.520 mg/L的甲醇溶液。

301F無機培養(yǎng)基以及苯甲酸鈉母液的制備方法參見文獻［13］（OECD標準）。

OxiTop OC 110 WTW 型BOD呼吸計：德國WTW公司； Acquity UPLC型超高效液相色譜系統(tǒng)：Waters公司。

1.2 實驗方法

OECD-301F 法是以受試物在一定時間內(nèi)被微生物氧化所需要的耗氧量（BOD，mg/L）［13］為指標，研究化學(xué)品的生物降解性的經(jīng)典方法，其結(jié)果反映的是化學(xué)品在環(huán)境中最終轉(zhuǎn)化為無機物的程度。因其方法規(guī)范嚴格且具有良好的實驗重現(xiàn)性和精確性，而被國外許多實驗室采用［14］。設(shè)備感測探頭可以在28 d內(nèi)連續(xù)記錄360個BOD數(shù)據(jù)，為降解動力學(xué)的分析提供足夠的數(shù)據(jù)支持［15］。

按照文獻［13］，采用BOD呼吸計進行OECD-301F 法實驗。將添加不同組分的反應(yīng)瓶分組，每組3個平行樣，啟動感測探頭后在22 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)28 d。根據(jù)反應(yīng)體系內(nèi)的氧氣消耗量，通過電化學(xué)分析過程得出BP-3和BP-4的BOD。

OECD-301F 法規(guī)定：受試物的濃度為理論需氧量 （受試物完全氧化時所需的耗氧量，ThOD）50.0～100.0 mg/L或質(zhì)量濃度為100 mg/L，接種物濃度（以活性污泥懸浮固體計）為30 mg/L［13］。本實驗兼顧方法規(guī)定以及污染物的實際環(huán)境濃度，設(shè)置BP-3的質(zhì)量濃度為30.00 mg/L（ ThOD=65.1 mg/ L），BP-4的質(zhì)量濃度為32.00 mg/L（ ThOD=51.5 mg/L），參比物苯甲酸鈉的質(zhì)量濃度為100.00 mg/L（ ThOD=167.0 mg/L）。實驗方案見表1。

表1 實驗方案

設(shè)置空白組的目的是為得到不含受試物時的接種物微生物的BOD；設(shè)置陽性對照組的目的是為了以苯甲酸鈉為參比物，驗證活性污泥的有效性；設(shè)置無菌對照組的目的是考察是否存在非生物轉(zhuǎn)化；設(shè)置毒性控制組的目的是為了考察受試物對微生物是否存在嚴重毒性抑制，以確保降解結(jié)果的可信度［13］。

根據(jù)BOD數(shù)據(jù)，按式（1）計算受試物的可生物降解率（α，%），以此來間接表征受試物的最終可生物降解程度［13］。

式中：BODS為試樣組生物需氧量的平均值，mg/ L；BODB為空白組生物需氧量的平均值，mg/L；ρ0為受試物的初始質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3 BP-3和 BP-4 的超高效液相色譜分析方法

檢測器：二極管陣列檢測器（PDA）；色譜柱：Waters BEH C18（50.0 mm ×2.1 mm×1.7μm）。柱溫：40 ℃；進樣體積：2 μL；體積流量：0.4 mL/min；檢測波長：285 nm（BP-3）， 320 nm（BP-4）。

BP-3的測定：流動相為不同體積分數(shù)的甲醇-水溶液。梯度洗脫順序：0～0.5 min，10%（甲醇體積分數(shù)，下同）；0.5～3.5 min，100%；3.5～7.0 min，10%。取250 mL含BP-3的混合洗脫液分3次加入100 mL 四氫呋喃，超聲處理30 min，磁力攪拌5 min。取10 mL混合溶液，加入10 mL四氫呋喃，混勻后取1.8 mL 二次混合溶液，13 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，甲醇稀釋100倍，用超高效液相色譜儀測定BP-3的質(zhì)量濃度。

BP-4的測定：流動相為不同體積分數(shù)的乙腈-水溶液。梯度洗脫順序為： 0～0.5 min，10%（乙腈體積分數(shù)，下同）；0.5～3.5 min，100%；3.5～3.7 min，10%；3.7～7.0 min，10%。取1.8 mL混合溶液，以13 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液100 μL，以體積分數(shù)為50%的乙腈-水溶液稀釋100倍，用超高效液相色譜儀測定BP-4的質(zhì)量濃度。

按式（2），由測定得到的質(zhì)量濃度計算BP-3和BP-4的初級降解率（β，%）。初級降解率表征的是有機物分子的原始結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的程度。

式中：ρN為無菌對照組的受試物質(zhì)量濃度，mg/L；ρS為試樣組的受試物質(zhì)量濃度，mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 BP-3和BP-4的好氧生物降解性能

陽性對照組及試樣組中苯甲酸鈉、 BP-3及BP-4的生物降解曲線見圖1。

圖1 陽性對照組及試樣組中苯甲酸鈉、 BP-3及 BP-4的生物降解曲線· 苯甲酸鈉；■ BP-3；▲ BP-4

根據(jù)OECD標準，陽性對照組的參比物在14 d時的可生物降解率要達到60%［13］。由圖1可見，在測試第5天，陽性對照組的苯甲酸鈉可生物降解率即達到65.00%，已滿足質(zhì)量控制要求，體現(xiàn)了實驗的有效性。

由圖1中BP-3的降解曲線可見：BP-3的可生物降解率首先經(jīng)歷大約6 d的遲滯期，該期間可生物降解率為負值，即受試物的BOD比空白低，說明微生物的呼吸受到BP-3的抑制，原因是微生物進入新環(huán)境時需要誘導(dǎo)特定的代謝酶，或具備降解BP-3能力的微生物需要足夠的增殖時間［16］；但是通過幾天的馴化后，微生物便能把BP-3作為碳源加以利用，使其得以迅速降解，第13天的BP-3可生物降解率超過60%，之后達到穩(wěn)定期，第28天時BP-3可生物降解率達到 68.36%。依據(jù)OECD快速生物降解性判定標準［13］，BP-3達到嚴格定義上的通過水平，可判定其為易生物降解物質(zhì)。美國毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫Toxnet有資料記載，采用標準OECD-301C MITI（I）法［13］（與OECD-301F 法類似）對BP-3進行快速生物降解實驗，其可生物降解率僅達4%，并沒有達到通過水平。這與本研究得到的結(jié)果存在明顯差異。筆者推斷原因可能是OECD-301C MITI（I）法的接種物不同于OECD-301F法，前者接種物源于實驗室馴化污泥［13］，而后者則來自于污水處理廠的新鮮活性污泥。Forney等［17］的研究結(jié)果表明，在實驗室馴化前后，新鮮活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，微生物種群多樣性減少，因此OECD-301C MITI（I）法規(guī)定使用的接種物可能使原本存在的BP-3高效降解菌在馴化過程中丟失。就接種物來看，本研究采用的方法結(jié)果更具代表性，更能反映實際環(huán)境中的降解效果。

由圖1中BP-4的降解曲線可見： BP-4的降解遲滯期較BP-3長，為15 d；而在第28天，BP-4的可生物降解率僅為41.34%，沒有達到通過水平，因此判定BP-4不易生物降解，說明BP-4在環(huán)境中只能部分降解。但該結(jié)果并不表示BP-4在環(huán)境中一定持久存在，若要證明這一點，需進行更高層次的模擬實驗。

從分子結(jié)構(gòu)看，BP-4僅比BP-3在苯環(huán)上多1個磺酸基團。王奕等［18］認為磺酸基增大了生物反應(yīng)的位阻效應(yīng)，削弱了微生物攻擊碳核的能力，阻礙了芳香族化合物的降解；另外由于極性比BP-3強，BP-4主要分布在水相，對污泥的親和力較弱，減少了微生物與其反應(yīng)的接觸面積。這兩個因素可能是BP-4比BP-3難降解的原因。

2.2 BP-3和BP-4的初級降解

分別取第28天的無菌對照組、試樣組溶液進行測定，生物降解前后BP-3和BP-4質(zhì)量濃度的變化見表2。

表2 生物降解前后BP-3和BP-4質(zhì)量濃度的變化

由表2可見：無菌對照組的BP-3和BP-4的殘留質(zhì)量濃度與初始質(zhì)量濃度基本一致，表明BP-3和BP-4在去離子水中穩(wěn)定，不易水解；在BP-3試樣組中，其殘留質(zhì)量濃度為2.88 mg/L，根據(jù)公式（2）計算得出其初級降解率為90.78%，說明BP-3基本完成初級降解。該初級降解率之所以高于由BOD計算得到的可生物降解率，是由于后者反映的是有機物完全轉(zhuǎn)變成無機小分子的程度，而前者僅代表化合物原始結(jié)構(gòu)的變化程度。Balmer等［19］對瑞士某污水處理廠進出水中的BP-3進行了測定，BP-3初級降解率為93%～100%，與本方法測得的初級降解率結(jié)果基本一致。另外從圖1中BP-3的生物降解曲線也可看出，BP-3降解的中間產(chǎn)物在環(huán)境中的保留時間也應(yīng)該較短，對環(huán)境的影響小。

由表2還可見：在BP-4試樣組中未檢出BP-4，可認為其初級降解率為100%，然而由BOD計算得到的可生物降解率卻很低（見圖1），說明BP-4生成了不易進一步轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物。通常，在好氧條件下，微生物對芳香族化合物的典型降解途徑是通過合成加氧酶在鄰位和間位的C—C鍵上形成C—O鍵，以推動苯環(huán)裂解，最后生成CO2和H2O［20］。BP-4的苯環(huán)上有1個磺酸基，這是鈍化反應(yīng)的基團，因此在BP-4分子結(jié)構(gòu)中最難打開的是磺酸基所連接的苯環(huán)。筆者根據(jù)以上兩點推斷了BP-4生物降解反應(yīng)的可能順序及中間產(chǎn)物（見圖2）。

圖 2 BP-4生物降解反應(yīng)的可能順序及中間產(chǎn)物

2.3 BP-3和BP-4的生物降解動力學(xué)分析

參考 Stasinakis等［21］的301F降解階段動力學(xué)研究方法，以最終BOD（BODult）表征發(fā)生徹底降解的有機物的濃度，用BODult與t時刻BOD測定值的差值（BODr）表征t時刻的有機物殘余濃度，將BODr隨時間t變化的數(shù)據(jù)采用不同函數(shù)進行擬合。擬合結(jié)果表明，用指數(shù)函數(shù)擬合的相關(guān)系數(shù)最高（R＞0.9）。BP-3和BP-4的生物降解動力學(xué)參數(shù)見表3。由表3可見，BP-3和BP-4的生物降解均符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型；BP-3和BP-4的半衰期分別為1.986 d和2.806 d。根據(jù)歐盟法規(guī)《化學(xué)品的注冊、評估、授權(quán)和限制》（REACH法規(guī)）對物質(zhì)在水環(huán)境中是否具備“持久性”的判定依據(jù)（物質(zhì)在淡水中半衰期大于40 d則具備持久性），該兩種物質(zhì)均不會持久存在。因為該標準是針對實際環(huán)境下的半衰期，所以BP-4是否為持久性物質(zhì)尚需更多數(shù)據(jù)支持。

表3 BP-3和BP-4的生物降解動力學(xué)參數(shù)

2.4 毒性控制組中的共代謝過程

陽性對照組、毒性控制組及試樣組中苯甲酸鈉、BP-3和BP-4的生物降解曲線分別見圖3、圖4。由圖3、圖4可見，第14天時，毒性控制組混合樣的可生物降解率均大于OECD法規(guī)定的質(zhì)量控制要求，說明在所設(shè)濃度條件下BP-3和BP-4對微生物的正常代謝基本是無毒的。

由圖3、圖4還可見，在實驗最后一天（即第28天），毒性控制組混合樣的可生物降解率分別為78.67%和67.09%，這比BP-3或BP-4單獨存在的試樣組的可生物降解率有所提高。由于OECD-301F法實驗中的無機培養(yǎng)基本身并不含碳源，筆者推斷可生物降解率的提高可能是因為共代謝作用［22］。

圖3 陽性對照組、毒性控制組及試樣組中苯甲酸鈉及BP-3的生物降解曲線· 陽性對照組的苯甲酸鈉；■ 毒性控制組的苯甲酸鈉和BP-3；▲ 試樣組的BP-3

圖4 陽性對照組、毒性控制組及試樣組中苯甲酸鈉及BP-4的生物降解曲線· 陽性對照組的苯甲酸鈉；■ 毒性控制組的苯甲酸鈉和BP-4；▲ 試樣組的BP-4

3 結(jié)論

a）在好氧條件下，微生物對BP-3或BP-4的降解均需要一段適應(yīng)時間。以BOD作為表征即時降解程度的參數(shù)，BP-3或BP-4的可生物降解率分別為68.36%和41.34%。根據(jù)OECD降解性判定標準，前者為易降解物質(zhì)，后者為難降解物質(zhì)。但BP-4比BP-3的初級降解程度略高，存在較穩(wěn)定的中間產(chǎn)物。

b）BP-3和BP-4的生物降解可用一級反應(yīng)動力學(xué)方程描述，擬合方程分別為BODr= 88.049e-0.349t和BODr= 68.087e-0.247t，半衰期分別為1.986 d 和2.806 d。依據(jù)REACH法規(guī)，BP-3和BP-4不屬于持久性物質(zhì)，但仍需進一步實驗確定BP-4是否具有持久性。

c） BP-3和BP-4分別與苯甲酸鈉共存時的生物降解均可能存在共代謝現(xiàn)象。

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［中圖分類號］X172

［文獻標志碼］A

［文章編號］1006 - 1878（2014）05 - 0423 - 06

［收稿日期］2014 - 02 - 17；

［修訂日期］2014 - 07 - 09。

［作者簡介］張弘（1989—），男，安徽省六安市人，碩士生，主要研究方向為水生生態(tài)毒理學(xué)。電話 021-38831500，電郵 zhanghong8907@163.com。

［基金項目］上海市技術(shù)性貿(mào)易措施應(yīng)對專項（13TBT012）。

Aerobic Biodegradability of Emerging Contaminants BP-3 and BP-4

Zhang Hong1，Yin Haowen2，Zhou Zhongliang1，Chen Xiaoqian2，Liu Min2
（1. School of Life Sciences， East China Normal University， Shanghai 200062， China；2. Bioassay and Safety Assessment Laboratory， Shanghai Academy of Public Measurement， Shanghai 201203， China）

Abstract:The aerobic biodegradabilities of 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone（BP-3） and 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic acid（BP-4） were studied by 301F manometric respirometry method， the OECD standard method for biodegradability test. Their degradation kinetics and co-metabolic phenomena were also explored. The experimental results show that： The biodegradation rates of BP-3 and BP-4 are 68.36% and 41.34% respectively； According to the OECD criterion of ready biodegradability， BP-3 is an easily degradable substance while BP-4 is difficult to be biodegraded ultimately； The biodegradation of the two substances can be described by the first order kinetics， and their half-lives are 1.986 d and 2.806 d respectively； According to the REACH rule，BP-3 and BP-4 are both non persistent substances； BP-3 and BP-4 can both co-metabolized with sodium benzoate during the degradation process.

Key words:2-hydroxy-4-methoxybenzophenone； 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic acid；aerobic biodegradation； 301F manometric respirometry method； half-life； co-metabolism