三七皂苷 Rb1對 局 部腦缺血 后 大鼠海馬 CA1區(qū)腦血流 及 GLT-1 的影響

安 冬， 羅海蕓， 王時云， 羅耀輝， 錢忠義， 吳蘭鷗*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系， 云南 昆明 650500； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)機能中心， 云南 昆明650500； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)系， 云南 昆明 650500）

［科研報道］

三七皂苷 Rb1對 局 部腦缺血 后 大鼠海馬 CA1區(qū)腦血流 及 GLT-1 的影響

安 冬1， 羅海蕓1， 王時云1， 羅耀輝2， 錢忠義3， 吳蘭鷗1*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系， 云南 昆明 650500； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)機能中心， 云南 昆明650500； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)系， 云南 昆明 650500）

目的 探討三七皂苷 Rb1對局部腦缺血后大鼠海馬 CA1區(qū)腦血流 （rCBF） 及神經(jīng)膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運體 （GLT-1）的影響。 方法 雄性 SD大鼠48 只， 隨機分為腦缺血假手術(shù)組、 模型組、 三七皂苷 Rb1、 尼莫地平治療組， 每組6 只，制成局灶性腦缺血模型， 各組于缺血后 4 h 腹腔給藥， 假手術(shù)組、 模型組給予生理鹽水； 缺血后 24 h 測海馬 CA1區(qū)rCBF水平； 測定 GLT-1 的表達， 觀測對比上述指標(biāo)變化。 結(jié)果 與模型組相比， 三七皂苷 Rb1、 尼莫地平治療組均能增加局部 rCBF（P＜0.05）， 并能上調(diào)大鼠海馬 CA1區(qū) GLT-1 的表達 （P＜0.05）。 結(jié)論 三七皂苷 Rb1能增加 rCBF，還能上調(diào) GLT-1 的表達， 發(fā)揮對神經(jīng)元損傷所起的保護作用， 為進一步研發(fā)三七皂苷 Rb1在治療缺血性腦疾患上提供實驗依據(jù)。

三七皂苷 Rb1； 局灶性腦缺血； 海馬 CA1區(qū)； 腦血流； 神經(jīng)膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運體； 大鼠

腦缺血是以腦循環(huán)血流量減少為特征的腦血管疾病，發(fā)病率占腦卒中的 70% ～80%， 并且具有高致殘、 高致死的特點［1］。 我國擁有大量的中草藥資源， 而中草藥又具有副作用小，價格便宜的優(yōu)點。中藥及其單體的藥理作用研究是近幾年心血管藥理研究的熱點方向之一。研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷及其主要成分 Rg1、 Rb1等對腦缺血有一定的保護作用［2］。 目前對三七皂苷 Rg1的研究很多， 但是對三七皂苷 Rb1的研究甚少， 而且機制尚不明確。 本實驗從三七皂苷 Rb1對腦缺血后大鼠局 部 腦 血 流 （ regional cerebral blood flow， rCBF） 及 神經(jīng) 膠 質(zhì) 谷 氨 酸 轉(zhuǎn) 運 體 （ glial glutamate transporter 1， GLT-1） 的影 響 方 面 入 手， 研 究 三 七 皂苷 Rb1在腦缺血中的作用， 旨在為三七系列產(chǎn)品治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患，特別是缺血性腦疾患提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康成年 SD大鼠 48 只， 雄性， 體質(zhì)量260 ～320 g， 由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供， 動物合格證號： SCXK （ 滇） 2011-0004。 隨機分為假手術(shù)組、 模型組、 缺血后給三七皂苷 Rb1高、 中、 低劑量組以及缺血后給尼莫地平高、中、低劑量組，各組動物均為6只。

1.2 藥品配制與主要試劑 三七皂苷 Rb1單體由昆明制藥廠提供， 為白色粉末狀 （純度 ＞98.57%）， 按最大劑量組100mg/kg計算， 需配 2 g/100mL， 中劑量組對半稀釋， 低劑量組再取中劑量組對半稀釋；尼莫地平注射液為德國拜耳公司 生 產(chǎn)， 規(guī)格 為 0.2 mg/mL； GLT-1 一 抗 由 Millipore公司生產(chǎn)， 100 μg濃縮型， 按 1 ∶100 稀釋； 二抗 pv-6000通用型二步法免疫組化試劑盒，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)； DAB顯色劑： DAB-0031， 由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要器材 大鼠腦立體定位儀 68000 型； PeriFlux System 5000 型激光多普勒 （LD） 血流測定儀； 采圖顯微鏡為Leica DM4000B高級顯 微 鏡； HPIAS-1000 高 清 晰 度 病 理 圖文分析系統(tǒng)。

1.4 大鼠局灶性腦缺血模型的制備及給藥 采用電凝閉大腦中動脈致局灶性腦缺血模型［3］， 加以改進， 大鼠以 3%戊巴比妥鈉 （10 mg/kg） 腹腔注射麻醉， 制成右側(cè)大腦中動脈腦缺血模型 （MCAO）。 缺血4 h 后， 按不同給藥劑量（均腹腔注射， 注射量均為 5 mL/kg）， 隨機分為 MCAO假手術(shù)組 （只手術(shù)， 不阻斷大腦中動脈， 給生理鹽水， 10 mg/kg）； MCAO模型組 （給生理鹽水， 10 mg/kg）； MCAO三七皂苷 Rb1高劑量組 （100 mg/kg）； MCAO三七皂苷Rb1中劑量組 （50 mg/kg）； MCAO三七皂苷 Rb1低劑量組（25 mg/kg）； MCAO 尼 莫 地 平 高 劑 量 組 （ 1 mg/kg）；MCAO尼莫地平中劑量組 （0.5 mg/kg）； MCAO尼莫地平低劑量組 （0.25 mg/kg）。

1.5 大鼠海馬 rCBF的測定 各組大鼠完成實驗過程后，于術(shù)后 24 h， 用 3%的戊巴比妥鈉麻醉后， 使用腦立體定位儀固定動物， 以人字縫為基準(zhǔn)， 人字點前 （4 mm）、 中線右側(cè) （3 mm） 坐標(biāo)處為穿刺點， 鉆開顱骨 （1 mm2）；自硬腦膜表面向下垂直推進4 mm至海馬，植入激光多普勒 血 流 儀 探 頭， 連 續(xù) 監(jiān) 測 rCBF （ 采 用 PeriFlux System 5000 型 LD血流測定儀和接觸式探頭及 Perimed 公司提供的 Perisoft配套軟件進行曲線輸出記錄） 。 血流儀將采集 信號轉(zhuǎn) 換 成 血 流 灌 注 單 位 （ perfusion unit， PU） =CMBC（一定體積內(nèi)細(xì)胞的分布率） ×V（平均血細(xì)胞的移動速率）［4］。

1.6 免疫組化染色法 動物 rCBF測量后， 麻醉 斷頭取腦， 并石蠟包埋腦組織于海馬處連續(xù)切片 （4 μm）， 采用 MaxVision 快 捷 法， 陽 性 細(xì) 胞 胞 漿 呈 棕 黃 色， 測 定 陽性細(xì)胞平均灰度值表示 GLT-1 陽性信號的相對強弱。 石蠟切片脫蠟、梯度乙醇脫水后，浸泡于蒸餾水中待用；對組織進行高壓抗原修復(fù)； 3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶， PBS （pH7.4） 沖洗 3 次； 非免疫小牛血清封閉10 min， 甩去血清， 不沖洗； 用 PBS 沖洗 3 次， 每 次 3 min； 除去 PBS 液， 加一抗 4 ℃冰箱下孵育過夜； PBS沖洗 3 次， 每次 3 min； 除 去 PBS 液， 加 二 抗， 室 溫 下孵育 15 min； PBS 沖洗 3 次， 每次 3 min； 除去 PBS 液，每張切片加50 μL新鮮配制的 DAB溶液， 顯微鏡下觀察3 ～5 m in； 自來水 沖洗， 切片經(jīng)梯度乙醇脫 水干燥， 二甲苯透明， 中性樹膠封固。 陰性對照用 PBS 代替一抗，其余步驟同上。

1.7 圖像分析 每張腦片選取海馬 CA1區(qū)5 個視野， 用高倍鏡 （ ×40） 下 HPIAS-1000 高清晰度病理圖文分析系統(tǒng)攝像、 分析， 半定量測定 GLT-1 陽性表達的動態(tài)變化， 以陽性細(xì)胞平均灰度值表示 GLT-1 陽性信號的相對強弱 （僅計算該視野細(xì)胞的平均灰度值）， 平均灰度值越低則表明染色越深，表達越強。

2 結(jié)果

2.1 三七皂苷 Rb1對 MCAO后大鼠海馬 CA1區(qū) rCBF的影響 結(jié)果見表 1。 與假手術(shù)組比較， 模型組 rCBF顯著減少， 差異有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義 （ P＜0.05） ； 三 七 皂 苷 Rb1高、中、 低劑量組與模型組比較差異均有顯著性 （P＜0.05），尼莫地平高、中、低劑量組與模型組比較差異均有顯著性（P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1中、 低劑量組與高劑量組相比差異顯著 （P＜0.05）， 尼莫地平中、 低劑量組與高劑量組相比差異顯著 （P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1高劑量組與尼莫地平高劑量組相比差異顯著 （P＜0.05）。

表 1 三七皂苷 Rb1對 MCAO后大鼠海馬 CA1區(qū) rCBF的影響 （， n=6）

表 1 三七皂苷 Rb1對 MCAO后大鼠海馬 CA1區(qū) rCBF的影響 （， n=6）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

腦血流值局灶性腦缺血假手術(shù)組 - 107.3 ±4.3組 別 劑量/（mg·kg-1）△局灶性腦缺血模型組 - 50.7 ±2.6*缺血后給三七皂苷 Rb1高劑量治療組 100 88.6 ±2.5*△缺血后給三七皂苷 Rb1中劑量治療組 50 75.0 ±1.2*△缺血后給三七皂苷 Rb1低劑量治療組 25 69.0 ±1.8*△缺血后給尼莫地平高劑量治療組 1 93.2 ±2.8*△缺血后給尼莫地平中劑量治療組 0.5 84.3 ±1.7*△缺血后給尼莫地平低劑量治療組 0.25 72.1 ±2.0*△

2.2 三七皂苷 Rb1對 MCAO后大鼠海馬 CA1區(qū) GLT-1 的影響 結(jié)果見表2。 缺血模型組相對假手術(shù)組表達增多 （P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1高、 中劑量組與模型組比較差異均有顯著性 （P＜0.05）， 尼莫地平高、 中劑量組與模型組比較差異均有顯著性 （P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1中、 低劑量組與高劑量組相比差異顯著 （P＜0.05）， 尼莫地平中、 低劑量組與高劑量組相比差異顯著 （P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1高劑量組與尼莫地平高劑量組相比無顯著差異 （P＞0.05）。 研究結(jié)果如圖 1 所示， GLT-1 陽性表達呈棕黃色， 表達于海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞漿。 在正常腦組織海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元少有 GLT-1 表達， 胞漿DAB染色呈弱陽性， 灰度值較高， 發(fā)生腦缺血后治療組與缺血模型組比較， GLT-1 表達明顯增高， 染色呈陽性，GLT-1 灰度值均降低。 假手術(shù)組大鼠海馬 CA1區(qū) GLT-1 陽性細(xì)胞數(shù)量較少，錐體細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核較大（圖1A）； 模型組大鼠海馬 CA1區(qū)可見錐體細(xì)胞排列稀疏， 細(xì)胞間隙增寬，個別錐體細(xì)胞水腫變形或細(xì)胞體積縮小等現(xiàn)象（圖1B）； 低劑量三七皂苷 Rb1組， 大鼠海馬 CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)與模型組基本一致，但出現(xiàn)個別錐體細(xì)胞水腫變形、陽性細(xì)胞數(shù)目增多等現(xiàn)象 （圖1F）； 中劑量三七皂苷 Rb1組與低劑量三七皂苷 Rb1組基本一致， 陽性細(xì)胞數(shù)目較低劑量增多 （圖1G）； 高劑量三七皂苷 Rb1組與中劑量三七皂苷 Rb1組基本一致，但出現(xiàn)個別錐體細(xì)胞水腫變形等現(xiàn)象，陽性細(xì)胞數(shù)目較中劑量增多 （圖1H）； 陽性對照組， 高劑量尼莫地平組大鼠海馬 CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)與高劑量三七皂苷 Rb1組基本一致， 也出現(xiàn)個別錐體細(xì)胞水腫變形等現(xiàn)象，陽性細(xì)胞數(shù)目與高劑量三七皂苷 Rb1組相當(dāng) （圖1E）。

表 2 三七皂苷 Rb1對 MCAO后大鼠海 馬 CA1區(qū) GLT-1表達的影響 （， n=6）

表 2 三七皂苷 Rb1對 MCAO后大鼠海 馬 CA1區(qū) GLT-1表達的影響 （， n=6）

注： 與假手術(shù)組比較，*P＜0.05， 與模型組比較，△P＜0.05

度值局灶性腦缺血假手術(shù)組 - 131.5 ±4.8組 別 劑量/（mg·kg-1）平均灰△局灶性腦缺血模型組 - 124.2 ±5.0*缺血后給三七皂苷 Rb1高劑量治療組 100 85.2 ±3.5*△缺血后給三七皂苷 Rb1中劑量治療組 50 109.0 ±6.2*△缺血后給三七皂苷 Rb1低劑量治療組 25 123.3 ±6.8*缺血后給尼莫地平高劑量治療組 1 89.8 ±3.7*△缺血后給尼莫地平中劑量治療組 0.5 115.2 ±8.4*△缺血后給尼莫地平低劑量治療組 0.25 122.9 ±6.9*

圖 1 各組大鼠腦部切片海馬 CA1區(qū) GLT-1 的免疫組化染色照片 （免疫組化染色 ×400）

3 討論

腦血管疾病的發(fā)生伴隨腦異常微環(huán)境的產(chǎn)生［5］。 腦微環(huán)境是腦細(xì)胞間質(zhì)及其中的體液成分參與構(gòu)成的腦細(xì)胞生存的微環(huán)境，微環(huán)境成分的異常變化可使腦細(xì)胞發(fā)生病變［6］。 腦微環(huán)境的變化是一個互動聯(lián)系的過程， 在腦缺血時，由于構(gòu)成神經(jīng)元微環(huán)境各因素間的相互作用，導(dǎo)致微環(huán)境損壞的放大， 形成異常微環(huán)境［7］。 腦缺血時海馬微環(huán)境內(nèi)興奮性氨基酸-谷氨酸增多， 以致離子在細(xì)胞內(nèi)外分布發(fā)生紊亂［8］。 有研究表明， 當(dāng)腦缺血時， 伴隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，谷氨酸的過量釋放可造成神經(jīng)元微環(huán)境的異常， 繼而又進一步損傷神經(jīng)元［9］。 因腦缺血的根本問題集中在 rCBF， 而海馬微環(huán)境的正常與否， 取決于 rCBF的消長變化［10］。 由于 LD血流儀可精確、 直觀地反映組織局部的缺血程度， 本研究應(yīng)用該技術(shù)記錄海馬 CA1區(qū) rCBF的動態(tài)變化， 研究三七皂苷 Rb1對改善 rCBF是否起作用。 本實驗結(jié)果顯示： 三七皂苷 Rb1高、 中、 低劑量和尼莫地平高、中、 低劑量均能改善局部缺血后大鼠海馬 CA1區(qū)的腦血流量， 三七皂苷 Rb1高劑量作用顯著， 尼莫地平高劑量作用顯著。

谷氨酸 （ glutamate， Glu） 是中樞 神 經(jīng)系統(tǒng) （ CNS） 最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)， 對正常腦功能和 CNS 的發(fā)育發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［11］。 由于細(xì)胞外不存在谷氨酸代謝酶系統(tǒng)， 谷氨酸的清除主要依靠谷氨酸轉(zhuǎn)運體的攝?。?2］。 目前已發(fā)現(xiàn) 5 種高親和性興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體 （EAATs）， 包括EAAT1 （ 又 稱 為 GLAST）、 EAAT2 （ 又 稱 為 GLT-1 ）、EAAT3、 EAAT4 和 EAAT5。 它們在腦內(nèi)的分布特征不同，一般認(rèn)為， GLAST和 GLT-1 為膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運體， 主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞； EAAC1、 EAAT4 和 EAAT5 為神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運體［13］。 正常情況下， 膠質(zhì)細(xì)胞的 GLT-1 對 Glu 的攝取轉(zhuǎn)運能力較神經(jīng)元強得多，是維持興奮性氨基酸濃度的主要轉(zhuǎn)運體［14］。 病理情況下， 谷氨酸轉(zhuǎn)運體能力會下降或者中斷， 引起突觸間隙或胞外谷氨酸大量蓄積［15］。 因此， 本實驗重在研究三七皂苷 Rb1對缺血后海馬 GLT-1 的影響。 本實驗結(jié)果顯示： 三七皂苷 Rb1高、 中劑量和尼莫地平高、中劑量均能上調(diào)局部缺血后大鼠海馬 CA1區(qū) GLT-1 的表達，三七皂苷 Rb1高劑量在同組比較中平均灰度值最低， 可見其作用顯著；尼莫地平高劑量在同組比較中平均灰度值最低，同樣可見其作用顯著，尼莫地平高劑量與三七皂苷Rb1高劑量相比無顯著差異。

通過本次研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷 Rb1能增加腦血流量， 還能上調(diào) GLT-1 的表達， 其機制可能是通過改善突觸間隙內(nèi)谷氨酸的濃度，使其趨于正常，達到改善異常微環(huán)境的目的， 從而增加腦血流量， 再改善異常微環(huán)境， 上調(diào) GLT-1的表達，形成循環(huán)，最終發(fā)揮對神經(jīng)元損傷所起的保護作用，從而發(fā)揮其對腦缺血的治療作用。這為進一步研發(fā)三七皂苷 Rb1在治療缺血性腦疾患上提供了實驗依據(jù)。

［ 1 ］ Taoufik E， Probert L.Ischemic neuronal damage［ J］ .Curr Pharm Des， 2008 ， 33（14） ： 3565-3573.

［ 2 ］ 閆俊嶺， 王云波， 楊克紅， 等.三七皂苷 Rg1 對大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬 BDNF mRNA表達的影響［J］.中成藥， 2007， 29（12）： 1826-28.

［3］ 羅 燕， 許能貴， 易 瑋， 等.電針對局灶性腦缺血大鼠缺血灶周圍區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體的影響［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2009， 28（1）： 30-33.

［4］ 羅海蕓，羅耀輝，后文俊，等.樹鼩海馬微環(huán)境谷氨酸異常與 rCBF相互作用的探討［ J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志， 2011，27（4）： 404-408.

［5］ 王時云，羅海蕓，吳蘭鷗.三七皂苷改善實驗性腦異常微環(huán)境及機制研究進展［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志， 2013，19（1）： 328-332.

［ 6 ］ 劉曉冬， 鄧 麗， 張擁波， 等.腦缺血后神經(jīng)發(fā)生［J］.國際腦血管病雜志， 2010， 18（7）： 537.

［7］ 劉 明，孫建寧，董世芬， 等.大鼠腦缺血不同時間腦能量代謝的變化研究［ J］.中國實驗方劑學(xué)雜志， 2011， 17（5）： 216.

［ 8 ］ Lehmann C， Bette S， Engele J.High extracellular glutamate modulates expression of glutamate transporters and glutamine synthetase in cultured astrocytes［ J］ .Brain Res， 2009， 1297：1-8.

［ 9 ］ Takano T， Oberheim N， Cotrina M L， et al.Astrocytes and ischemic injury［ J］.Stroke， 2009 ， 40（3 Suppl） ： S8-S12.

［10］ 羅海蕓， 羅耀輝， 李樹清.樹鼩海馬微環(huán)境 Ca2+異常與rCBF相互作用機制的探討［ J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志， 2011，27（1）： 63-66.

［11］ Zhang M， LiW B， Liu Y X， et al.High expression of GLT-1 in hippocampal CA3 and dentate gyrus subfields contributes to their inherent resistance to ischemia in rats［J］ .Neurochem Int，2011， 59（7）： 1019-1028.

［12］ 李成敏， 顏 慧， 宮澤輝.谷氨酸轉(zhuǎn)運體亞型谷氨酸轉(zhuǎn)運體1 與其調(diào)控藥物的研究進展［J］.中國藥理學(xué)通報，2009， 25（10）： 1264-1268.

［13］ Lehmann C， Bette S， Engele J.High extracellular glutamate modulates expression of glutamate transporters and glutamine synthetase in cultured astrocytes［ J］ .Brain Res， 2009， 1297（10）： 1-8.

［14］ 祁亞瓊， 武 衡.腦出血中谷氨酸及其轉(zhuǎn)運體的參與［ J］.社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志， 2013， 11（1）： 10-12.

［15］ Liu A J， Hu Y Y， LiW B， et al.Cerebral ischemic pre-conditioning enhances the binding characteristics and glutamate uptake of glialglutamate transporter-1 in hippocampal CA1 subfield of rats［ J］.JNeurochem， 2011， 119（1） ： 202-209.

R285.5

： B

： 1001-1528（2014）03-0605-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.035

2013-05-11

云南省教育廳研究生基金 （2011J035）； 云南省科技廳—昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合項目 （2013FZ054）

安 冬 （1988—） ， 女， 碩士生， 從事腦血管藥物方面的研究。 Tel： 15198989229， E-mail： gogoandong@126.com

*通信作者： 吳蘭鷗， 女， 碩士， 教授， 碩士生導(dǎo)師， 從事心腦血管藥物方面的研究。 E-mail： lanouwu@126.com