羅漢果甜苷對體外人肝星狀細胞活化和凋亡的影響

宋開娟， 廖長秀， 劉燕平， 陳湘蕓， 黃岑漢*

（1.廣西中醫(yī)藥大學， 廣西 南寧 530001； 2.右江民族醫(yī)學院， 廣西 百色 533000）

羅漢果甜苷對體外人肝星狀細胞活化和凋亡的影響

宋開娟1， 廖長秀2， 劉燕平1， 陳湘蕓1， 黃岑漢2*

（1.廣西中醫(yī)藥大學， 廣西 南寧 530001； 2.右江民族醫(yī)學院， 廣西 百色 533000）

目的 研究羅漢果甜苷對體外培養(yǎng)人肝星狀細胞 LX-2 活化及凋亡的影響。 方法 體外培養(yǎng) LX-2， 將其分為空白對照組、 不同質量濃度的羅漢果甜苷干預組 （80、 160、 240、 320 μg/m L）， 每組 8 瓶細胞， 藥物與細胞共同孵育24 h 后， 采用 CCK-8 試劑檢測細胞增殖狀態(tài)， 用酶聯(lián)免疫吸附法測定轉化生長因子-β1 （TGF-β1） 和Ⅰ型膠原的蛋白分泌， 用 RT-PCR法檢測 TGF-β1 和 α-平滑肌肌動蛋白 （α-SMA） 的 mRNA的表達。 用流式細胞儀雙染法檢測細胞凋亡。 結果 CCK8 結果顯示羅漢果甜苷各劑量組作用 LX-2 細胞 24 h 后， 細胞增殖均明顯降低 （ P＜0.05）； ELISA和RT-PCR結果表明， 與空白對照組比較， 羅漢果甜苷各劑量組可抑制 LX-2 中 TGF-β1 和Ⅰ型膠原的蛋白分泌； 并能抑制 TGF-β1 和 α-SMA的 mRNA表達 （P＜0.05）。 流式細胞檢測結果顯示羅漢果甜苷各劑量組亦可劑量依賴性顯著增加 LX-2 凋亡率。 結論 羅漢果甜苷可通過抑制 TGF-β1 和 I型膠原的蛋白及 TGF-β1 和 α-SMA的 mRNA的表達來抑制肝星狀細胞活化，還能促進肝星狀細胞凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

羅漢果甜苷；肝星狀細胞；活化；凋亡

肝纖維化是肝硬化的早期病變，是由各種慢性肝病引起的慢性肝損傷。肝纖維化發(fā)生時，肝內纖維結締組織異 常 增生， 細胞外 基 質 （extracellular matrix， ECM）的合成和降解失衡， 導致 ECM在肝內過度沉積，其中肝星狀細胞的活化、增殖并轉變?yōu)榧〕衫w維細胞是 ECM的主要來源［1］。 羅漢果甜苷是羅漢果提取物的主要有效成分，主要藥理作用包括：祛痰、鎮(zhèn)咳、清除自由基及抗氧化活性、增強免疫、 抗癌［2］， 并且有研究證明其對大鼠及小鼠急慢性肝損傷有保護作用，具體作用機制尚不明確［3-5］。為進一步探討羅 漢果甜苷抗肝纖維 化的作用機制， 本實驗采用 CCK8、 RT-PCR和 ELISA等方法，探討羅漢果甜苷對肝纖維化發(fā)生關鍵細胞——人肝星狀細胞 LX-2 活化和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝星狀細胞株 （LX-2） 購于中南大學湘雅中心實驗室細胞庫； 羅漢果甜苷 （其成分為羅漢果苷 V， 質量分數為 63.49%， 含水分量為3.46%， 灰分為 0.79%）， 購于廣西桂林萊茵生物科技股份有限公司。 胎牛血清、 DMEM培養(yǎng)液購于 Gibco公司； CCK-8 試劑為碧云天生物技術研究所產品； ELISA試劑盒購于上海拜沃生物科技公司； RNA逆轉錄試劑盒購于 Fermentas公司； SuperReal PreMix為天根公司產品。 細胞凋亡試劑盒購于凱基生物。 實時熒光定量 PCR儀和凝膠成像分析系統(tǒng)為美國伯樂公司產品；流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) LX-2 置于含 10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基、5%CO2、37 ℃、 飽和濕度的條件下培養(yǎng)， 復蘇及傳代后次日換液，1～2 d換液，并密切觀察培養(yǎng)液顏色及細胞狀態(tài)，當細胞呈單層覆蓋瓶底時，用 0.25%的胰酶消化， 按照 1 ∶2 的比例傳代。

1.2.2 實驗分組及處理 空白對照組加入 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液； 用 10% 胎 牛血清 的DMEM培養(yǎng)液將羅漢果提取物稀釋成不同質量濃度， 分別為 80、160、 240、 320 μg/mL。 待細胞60%融合， 更換為無血清培養(yǎng)基同步化24 h， 然后再加藥干預 24 h。

1.2.3 CCK-8 試劑檢測細胞活化 用 96 孔板培養(yǎng)細胞， 共分 5 組， 每組 10 孔細胞， 待藥物干預 24 h 后， 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液， 置 37 ℃恒溫振蕩箱孵育1 h， 在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光值。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測轉化生長因子-β1（TGF-β1） 和Ⅰ型膠原的蛋白表達 根據藥物質量濃度將實驗分為5組，每組8瓶細胞，將細胞加藥干預24 h 后， 收集每瓶細胞培養(yǎng)液上清于 1.5 mL EP管， 按照 TGF-β1 和Ⅰ型膠原酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明操作， 最后使用酶標儀在 450 nm下讀取吸光度值，記錄數據并繪制標準曲線。

1.2.5 RT-PCR法檢測 TGF-β1 和 α-平滑肌肌動蛋白 （α-SMA） mRNA的表達 藥物處理方法同前，設置5 個實驗組， 每組8 瓶細胞， 干預24 h后用Trizol裂解液將細胞裂解， 提取總 RNA； 用紫外分光光度法檢測總 RNA純度和濃度； 按照逆轉錄試劑盒說明，將總 RNA逆轉錄成 cDNA。利用 Primer 5.0 設計其引物序列， β-actin 為內參， 引物序列及產物長度見表 1。 反應條件： 95 ℃預變性 15 min，95 ℃變性 10 s； 60 ℃變性 30 s共 45 個循環(huán)； 55℃ ～95 ℃， 每 30 s連續(xù)升溫檢測熒光值及擴增產物熔解曲線， 共 81 個循環(huán)。 反應結束后以 β-actin為參照物， 計算出各組 mRNA表達情況。

表 1 TGF-β1、 α-SMA和 β-actin引物序列及產物長度Tab.1 TGF-β1， α-SMA and beta actin primers sequences and the length of the product

1.2.6 流式細胞儀雙染法檢測細胞凋亡 設置為5組，每組3瓶細胞，按照實驗方法對細胞進行干預后， 棄培養(yǎng)液， 加入不含 EDTA胰酶消化后， 離心， 用 PBS 洗滌 細 胞 兩次， 加入 500 μL Binding Buffer懸浮細胞， 加入 5 μL FITC混勻后， 再加入5 μL PI混勻， 室溫避光， 反應 15 min 后進行流式細胞儀檢測。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 應用 SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料均用均值±標準差表示，采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 CCK-8 試劑檢測細胞活化情況 細胞培養(yǎng)板孔內細胞加入 CCK-8 試劑后 1 h， 可見培養(yǎng)液顏色變淺，且高質量濃度組顏色較低質量濃度組稍淺。80 ～320 μg/m L質量濃度 OD值較空白組均有不同程度降低，隨著質量濃度增高，對細胞增殖抑制明顯 （表2）。

表 2 不同質 量 濃 度 羅 漢 果 甜 苷 對 抑 制 LX-2 活 化 的 影 響（n=10，）Tab.2 Influence on inhibiting LX-2 activation with different concentration mogroside（ n=10，）

表 2 不同質 量 濃 度 羅 漢 果 甜 苷 對 抑 制 LX-2 活 化 的 影 響（n=10，）Tab.2 Influence on inhibiting LX-2 activation with different concentration mogroside（ n=10，）

注： 與空白對照組相比，*P＜0.05

組 別 劑量/（μg·mL-1） OD值 抑制率/%空白對照組 0.329 ±0.013—羅漢果甜苷組 80 0.305 ±0.008* 7.6羅漢果甜苷組 160 0.272 ±0.037* 17.4羅漢果甜苷組 240 0.228 ±0.032* 48.3羅漢果甜苷組 320 0.171 ±0.017*50.1

2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定 法檢測 LX-2 培養(yǎng)基中TGF-β1 及Ⅰ型膠原的蛋白分泌量 隨著羅漢果甜苷質量濃度的增高其 TGF-β1 及Ⅰ型膠原的蛋白表達下降，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05） （見表 3）。

表 3 羅漢果甜苷對 LX-2 中Ⅰ型膠原及 TGF-β1 的蛋白表達影響 （n=8，）Tab.3 Expression influence on collagenⅠ and TGF-β1 protein with mogroside in LX-2 （ n=8，）

表 3 羅漢果甜苷對 LX-2 中Ⅰ型膠原及 TGF-β1 的蛋白表達影響 （n=8，）Tab.3 Expression influence on collagenⅠ and TGF-β1 protein with mogroside in LX-2 （ n=8，）

注： 與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別 劑量/（ μg·m L-1）Ⅰ型膠原/（pg·mL-1）TGF-β1/（pg·m L-1）空白對照組17.264 ±0.591 42.261 ±0.991羅漢果甜苷組 80 16.693 ±0.519*32.925 ±0.899*羅漢果甜苷組 160 15.851 ±0.411*24.791 ±0.804**羅漢果甜苷組 240 15.418 ±0.367*20.505 ±0.768*羅漢果甜苷組 320 13.781 ±0.879*18.339 ±0.892*

2.3 RT-PCR法檢 測 TGF-β1 及 α-SMA mRNA的表達 LX-2 經羅漢果甜苷作用 24 h 后， TGF-β1 的mRNA表達呈下降趨勢 （見表 4）， 其中 80 μg/mL及 160 μg/mL藥物質量濃度干預后與空白對照組比較無明顯差異 （P＞0.05）， 后兩組藥物質量濃度與空白對照組比較有明顯差異 （P＜0.05）。 α-SMA的 mRNA表達呈下降趨勢， 320 μg/mL藥物質量濃度組與空白對照組比較有明顯差異 （P＜0.05）。

表 4 羅 漢果甜 苷 對 LX-2 中 TGF-β1 和 α-SMA的 m RNA的表達影響 （n=8，）Tab.4 Influence on TGF-β1 andα-SMA m RNA exp ression w ith mogroside in LX-2 （ n=8，）

表 4 羅 漢果甜 苷 對 LX-2 中 TGF-β1 和 α-SMA的 m RNA的表達影響 （n=8，）Tab.4 Influence on TGF-β1 andα-SMA m RNA exp ression w ith mogroside in LX-2 （ n=8，）

注： 與空白對照組比較，*P＜0.05

組 別 劑量/（ μg·m L-1）TGF-αβ12-ΔΔCT值SMA2-ΔΔCT值1.074 ±0.451 1.019 ±0.244羅漢果甜苷組 80 0.907 ±0.443 0.742 ±0.443羅漢果甜苷組 160 0.678 ±0.167 0.753 ±0.418羅漢果甜苷組 240 0.430 ±0.414* 0.790 ±0.127羅漢果甜苷組 320 0.426 ±0.254* 0.353 ±0.181空白對照組*

2.4 流式細胞儀雙染法檢測細胞凋亡 結果顯示，與空白對照組比較， 羅漢果甜苷組作用于 LX-2 24 h， 細胞凋亡率增加， 且有顯著性差異 （P＜0.05）， 其凋亡率隨羅漢果甜苷質量濃度增高而升高，見表5。

3 討論

近年來研究表明，在正常肝臟內，LX-2 處于靜止狀態(tài)， 當 LX-2 受到炎性細胞因子等病理因素刺激后，活化并大量增殖，其活化和功能改變是肝纖維化發(fā)生的關鍵。 在 LX-2 激活 的持續(xù)階段，LX-2 出現很多表型變化， 包括增殖、 收縮、 基質降解、纖維形成、維生素A缺乏和細胞因子釋放等。 其中 TGF-β1 是最重要的促肝纖維化細胞因子［6-7］，它具 有 活 化 LX-2、促 進 膠 原 纖 維 和 ECM的合成及沉積等多種作用。 而反映 LX-2 的活化和向肌成纖維細胞的轉化的標志指標為 α-SMA［8］， 其表達量的多少可用來衡量肝星狀細胞的激活程度［9-10］， 隨著肝 星狀 細 胞 培養(yǎng) 活 化 α-SMA表 達 逐步增加［11］。 同時激活的 LX-2 合成大量的以Ⅰ、 Ⅲ型膠原為主的 ECM［12］，其中Ⅰ型膠原增多最為顯著。 Ⅰ型膠原可促進 LX-2 激活、增殖，并抑制肝細胞及竇內皮細胞的增生，促進肝纖維化的發(fā)展。因此阻斷細胞因子促增殖的作用，將成為治療肝纖維化的有效手段。

表 5 羅漢果甜苷對 LX-2 凋亡的影響 （n=3，）Tab.5 Influence on the LX-2 apoptosis w ith mogroside（n=3，）

表 5 羅漢果甜苷對 LX-2 凋亡的影響 （n=3，）Tab.5 Influence on the LX-2 apoptosis w ith mogroside（n=3，）

注： 與空白對照組相比，*P＜0.05

組 別 劑量/（μg·m L-1） 凋亡率/%空白對照組 —1.97 ±0.15羅漢果甜苷組 80 7.70 ±0.30*羅漢果甜苷組 160 10.16 ±0.23*羅漢果甜苷組 240 14.33 ±0.25*羅漢果甜苷組 320 16.53 ±0.41*

近年來研究證實，羅漢果甜苷除具有祛痰、止咳、 潤腸通便［13］等作用外， 經過實驗還證實其有阻止肝細胞脂肪變性［14］， 并對肝纖維化大鼠有保護作用［15］， 但在該藥對 LX-2 的基因和蛋白表達的調節(jié)作用還未見報道， 因此本實驗運用 RT-PCR、ELISA、 流式細胞術等方法， 檢測羅漢果甜苷對LX-2 中 TGF-β1、 Ⅰ型膠原的蛋白及 TGF-β1 和 α-SMA的 mRNA表達的影響及細胞凋亡情況， 結果表明， 隨藥物質量濃度增高， 藥物對 LX-2 的活化抑制作用增強， LX-2 中 TGF-β1， α-SMA和Ⅰ型膠原的蛋白及 mRNA的表達下降， 并且細胞凋亡呈下降趨勢， 這說明羅漢果甜苷可以抑制 LX-2 中TGF-β1， Ⅰ型膠原的蛋白分泌； 并能抑制 TGF-β1和 α-SMA、 的 mRNA的表達， 還能促進細胞凋亡，從而抑制 LX-2 中 ECM的合成， 發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

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Effect of activation and apoptosis ofmogroside on hepatic stellate cell

SONG Kai-juan1， LIAO Zhang-xiu2， LIU Yan-ping1， CHEN Xiang-yun1， HUANG Cen-han2*
（1.Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China； 2.Youjiang Medical College for Nationalities， Baise533000， China）

mogroside； hepatic stellate cell； activation；apoptosis

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0481-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.008

2013-06-12

廣西科技攻關課題 （0992003A-12； 0898001）； 國家自然科學基金 （81060040）

宋開娟 （1982—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中醫(yī)診法與辨證規(guī)范化客觀化。 E-mail： songkaijuan@163.com

*通信作者： 黃岑漢 （1959—） ， 男， 教授， 研究方向： 中醫(yī)診法與辨證的規(guī)范化客觀化及民族醫(yī)藥。 E-mail： hchgx@sina.com