GC法測定小鼠灌胃給予艾片后腦組織中的龍腦

田 徽， 王 建， 高 天， 馬 驍， 羅鳳娟， 黃 聰

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 四川 成都 611137； 2.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 四川 綿陽621000）

GC法測定小鼠灌胃給予艾片后腦組織中的龍腦

田 徽1，2， 王 建1*， 高 天1， 馬 驍1， 羅鳳娟1， 黃 聰1

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 四川 成都 611137； 2.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 四川 綿陽621000）

目的 建立測定灌胃給予艾片后小鼠腦組織中龍腦的方法，比較灌胃給予艾片與合成冰片后兩者在腦組織的透過率。 方法 樣品經(jīng)環(huán)己烷提取， 由 GC檢測腦組織中龍腦的透過率。 WCOT FUSED SILICA色譜柱 （30 m×0.25 mm， 0.25 μm） ； 柱溫為 90 ℃保持 1 min， 以 3 ℃ /min 上升至 140 ℃， 以 25 ℃ /min 上升至 210 ℃保持 5 min； FID檢測器 220 ℃； 進(jìn)樣口為 200 ℃； 載氣為 N2； 燃?xì)鉃?H2； 助燃?xì)鉃榭諝猓?體積流量 1.0mL/min； 分流比 1 ∶20。 結(jié)果測定方法的精密度及回收率均符合生物樣品中活性成分定量測定的要求。 艾片灌胃 5 min 的龍腦透過率即可達(dá)0.174%， 在 15 min 左右基本達(dá)最高峰， 為 0.225%， 之后逐漸減少。 合成冰片灌胃 5 min 的龍腦透過率為 0.113%，于 20 m in 達(dá)最高峰， 為 0.190%， 之后迅速減少。 結(jié)論 艾片組腦組織所含龍腦進(jìn)入腦組織的速度及透過率均略優(yōu)于合成冰片組。

艾片；合成冰片；龍腦；GC

艾片為菊科植物 艾 納 香 Blumea balsamifera （ L.） DC.的新鮮葉經(jīng)提取加工制成的結(jié)晶。 《藥材資料匯編》 記載其： 甘， 溫平， 無毒”。 《廣西中藥志》 載其： “味辛苦，性溫， 無毒”。 主治方面， 《藥材資料匯編》 載其： “去惡氣， 辟瘟疫， 殺蟲療癬， 治中暑霍亂”。 《中國藥典》 2010年版一部記載其： “辛、 苦，微寒。歸心、 脾、 肺經(jīng)。 功效主治：開竅醒神，清熱止痛。用于熱病神昏、痙厥，中風(fēng)痰厥，氣郁暴厥，中惡昏迷，目赤，口瘡，咽喉腫痛，耳道流膿”。 其功效與記載合成冰片一致［1］。 目前雖有關(guān)于冰片在血液及腦組 織中成分定 量測定的報(bào) 道［2-10］， 也有部分測定含艾片在血液及腸中的量的報(bào)道［11-12］， 但未見艾片在腦組織中含有量測定的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜法，建立了小鼠灌胃艾片后腦組織中龍腦的檢測方法，測定了小鼠灌胃給予艾片與合成冰片后腦組織中龍腦的量，并比較了給予艾片與合成冰片后腦組織中龍腦的透過率，為進(jìn)一步比較艾片與合成冰片的腦保護(hù)作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀 器 Varian450-氣 相 色 譜 儀 （ 美 國 Varian 公 司） ，BP211D電 子 天 平 （ 德 國 Sartorius公 司 ） ， 5415D離 心 機(jī)（德國 Eppendof） 公司， WH-3 旋渦振蕩器 （上海滬西分析儀器廠）。

1.2 動(dòng)物 KM種雄性小鼠， 成都達(dá)碩生物科技有限公司提供， 許可證號 SCXK （川） 2008-24。

1.3 藥品與試劑 艾片 （貴州羅甸產(chǎn)艾納香采用蒸餾提取法制取所得， 經(jīng)測定其含龍腦 87.03%）， 合成冰片 （購于綿陽天誠大藥房， 經(jīng)測定其含龍腦 57.34%）， 均符合 2010年版 《中國藥典》 要求。 龍腦對照品 （中國藥品生物制品檢定所， 110881-201107）， 環(huán)己烷 （ 色譜純， 成都科龍?jiān)噭┯邢薰荆?萘 （色譜純， 成都科龍?jiān)噭┯邢薰荆?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色 譜條件 WCOT FUSED SILICA色譜柱 （30 m × 0.25 mm ID COATING： CP-SIL 8 CB DF=0.25 μm）； 柱溫在 90 ℃ 保 持 1 min， 以 3 ℃ /min 上 升 至 140 ℃， 以 25℃ /min上升至 210 ℃保持 5 min； FID檢測器 220 ℃； 進(jìn)樣口為200 ℃； 載氣為 N2； 燃?xì)鉃?H2； 助燃?xì)鉃榭諝猓?體積流量 1.0 mL/min； 分流比 1 ∶20。

2.2 溶液配制

2.2.1 內(nèi)標(biāo)萘液的配制 稱取萘 11.9 mg， 用環(huán)己烷溶解并稀釋至 10 mL， 再精密吸取 1 mL， 用環(huán)己烷稀釋至 10 mL， 得到 0.119 mg/mL的內(nèi)標(biāo)萘溶液。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取約 10 mg龍腦對照品， 用環(huán)己烷定容于 10 mL量瓶中， 得質(zhì)量濃度為 1.015 mg/mL的龍腦的對照品貯備液。 分別用環(huán)己烷稀釋至約0.507 5 mg/mL、 0.101 5 mg/mL、 0.050 75 mg/mL、0.010 15 mg/mL、 0.005 507 5 mg/mL。

2.3 樣本采集 將 30 只 KM小鼠分為 10 組， 每組 3 只，灌胃給 予 艾 片 （ 已 測 定 其 含 龍 腦 量 為 87.03%） 500 mg/kg， 于給藥后 0、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 60、 90 min后取腦組織， 制成勻漿液 （1 mL生理鹽水溶解 0.1 g組織）， 取 lmL勻漿液， 加入 20 μL內(nèi)標(biāo)萘液， 用 1mL的環(huán)己烷旋渦振蕩 3 m in， 15 000 r/min 離心 10 min， 即得艾片樣液。 另取 30 只小鼠 KM小鼠分為 10 組， 每組 3 只， 同法灌胃給予 500 mg/kg合成冰片 （已測定其含龍腦量為57.34%）， 與相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)采集及處理得合成冰片樣液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法專屬性 在上述色譜條件下， 龍腦對照品在9.65min 時(shí)出峰， 內(nèi)標(biāo)萘在 10.25min 時(shí)左右出峰， 二者分離效果較好，見圖1。

圖1 對照品及部分樣品 GC色譜圖

2.4.2 腦組織內(nèi)龍腦標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 取 1 mL空白腦組織勻漿液 （1 m L生理鹽水溶解 0.1 g組織） 中加入 20 μL內(nèi)標(biāo)萘液和20 μL相應(yīng)的龍腦對照品貯備液， 用1mL的環(huán)己烷旋渦振蕩 3 min， 15 000 r/m in 離心 10 min， 吸取上清液1μL直接進(jìn)樣， 記錄色譜圖， 以最終進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各龍腦峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程 為 y=0.329 8x-0.014 8， r2=0.999 2， 可 見進(jìn)樣線性范 圍 為0.101 5 ～20.30 μg/mL， 該 方 法 最 低 檢 測 限 為0.101 5 μg/mL。

2.4.3 精 密度試驗(yàn) 取 1 m L空 白 腦 組 織 勻 漿 液 ， 分 別 加入 龍 腦 對 照 品 貯 備 液 （0.5 mg/mL、 0.05 mg/mL、 0.005 mg/mL） 20 μL和內(nèi)標(biāo)液 20 μL， 制成高、 中、 低 3 個(gè)含有量的樣品， 每個(gè)質(zhì)量濃度做 5 個(gè)平行樣， 按 “2.4.2” 項(xiàng)方法連續(xù)測5 d， 記錄色譜圖。 計(jì)算日內(nèi)和日間 精密度。 高、中、 低 質(zhì) 量 濃 度 日 內(nèi) 精 密 度 分 別 為 7.49%、 4.26%、5.12%； 日間精密度分別為 7.60%、 3.63%、 6.22%。 按照生物樣品中精密度用質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD） 表示， RSD一般應(yīng)小于 15%， 在 LLOQ附近 RSD應(yīng)小于 20%.本測定方法的精密度符合要求［13］。

2.4.4 回收率試驗(yàn)

2.4.4.1 相對回收率 由 “2.4.3” 項(xiàng)記錄的色譜圖， 計(jì)算龍腦測得量，將其與加入龍腦對照品的量相比計(jì)算，得到相對回收率。高、中、低質(zhì)量濃度的相對回收率分別為97.76% ±7.29% （ RSD 為 7.45%） ， 99.95% ±4.07%（RSD為 4.07%）， 106.71% ±3.20% （RSD為 3.00%）。按照 相 對 回 收 率 應(yīng) 為 85% ～115% （ LLOQ附 近 80 ～120%） ， 該定量測定方法的相對回收率符合要求［13］。

2.4.4.2 提取回收 率 于 1 mL環(huán)己烷中， 分 別 加 入 0.5 mg/mL、 0.05mg/mL、 0.005 mg/mL的 龍 腦對照品 貯 備 液20 μL， 加入 20 μL內(nèi)標(biāo)萘液， 吸取上清液 1 μL直接進(jìn)樣，記錄色譜圖， 計(jì)算樣品中龍腦的量。 將由 “2.4.3” 項(xiàng)記錄的生物樣品龍腦峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積與不加空白血漿配制的相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液直接進(jìn)樣測定得到的龍腦峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積進(jìn)行比較，得到提取回收率。高、中、低質(zhì)量濃度 的 提 取 回 收 率 分 別 為 86.11% ±6.45% （ RSD 為7.49%） ， 85.91% ±3.66% （RSD為 4.26%） ， 83.94% ± 4.30% （RSD為 5.12%）。 該定量測定方法的提取回收率符合要求［13］。

2.5 樣本測定 吸取樣品上清液 1 μL直接進(jìn)樣， 記錄色譜圖， 測定腦組織中的含有量 （μg/g）， 并計(jì)算每個(gè)樣本的透過率。 透過率 （%） =腦組織中龍腦量/給予的龍腦量。 結(jié)果如表 1、 表 2， 圖 2。

表 1 艾片與合成冰片樣液給藥后腦組織中龍腦量的比較 （n=3）

表2 艾片與合成冰片樣液給藥后腦組織中龍腦透過率的比較（n=3）

圖2 艾片與合成冰片樣液給藥后腦組織中龍腦透過率的比較

由表1， 表2及圖2可以看出， 艾片灌胃后， 龍腦迅速進(jìn)入腦組織， 5 m in 后即可達(dá) 0.174%， 在 15 min 左右基本可達(dá)最高峰， 最高值為 0.225%， 之后逐漸減少， 60min 基本只有最高值的一半左右， 在 90 min 僅存 0.070%。

而合成冰片灌胃后，龍腦進(jìn)入腦組織比例略低于艾片，5 min 僅為 0.113%， 而其最高峰出現(xiàn)也 晚于艾片， 于 20 min 達(dá)最高峰， 最高值也明顯低于艾片， 僅為 0.190%， 之后迅速 減 少， 且 消 除 速 度 也 較 艾 片 快， 在 90 min 僅存 0.026%。

3 討論

冰片是開竅醒神常用中藥， 《中國藥典》 2010 年版一部收載與冰片相關(guān)藥物有 3種 ［天然冰片、 艾片與冰片（合成龍腦）］， 但是藥典中并未將這3 種冰片的功效主治加以區(qū)分。目前，國內(nèi)僅張伯禮課題組比較了合成冰片與天然冰片的毒性研究［14-15］， 而 關(guān) 于 艾 片 的 藥 理 及 毒 性研 究，特別是艾片與合成冰片的功效及作用機(jī)理比較研究國內(nèi)外尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于艾片 “開竅醒神” 的主要功效，選擇其在靶器官腦組織的分布進(jìn)行研究。

關(guān)于成分定量測定的方法方面，本實(shí)驗(yàn)建立了測定小鼠灌胃艾片后腦組織中龍腦的方法，該方法的精密度及回收率均符合生物樣品中物質(zhì)定量測定的要求，因此該方法可行，合理。給予相同劑量的艾片和合成冰片后，艾片組小鼠腦組織中所含龍腦大于合成冰片組。

關(guān)于選擇透過率來比較的依據(jù)方面，由于艾片中龍腦含有量約為 85%， 而合成冰片中龍腦含有量約為 57%， 兩組小鼠灌胃給予相同劑量，但實(shí)際各藥液所含龍腦自身存在的相差性不可避免。如果僅采用腦組織中龍腦量的絕對值來比較艾片與合成冰片給藥后腦組織分布多少，可能不能全面反映出二者的吸收差異。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)基于二者所含龍腦的相對量，即進(jìn)入腦組織的龍腦量所占給予龍腦實(shí)際量的百分比進(jìn)行比較，故該數(shù)據(jù)可以相對更全面客觀反映出艾片與合成冰片在生物體腦組織中分布的差異。

血腦屏障對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的意義，透過血腦屏障率反映了治療藥物進(jìn)入腦內(nèi)的量，是藥物治療腦部疾病的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，艾片所含龍腦能迅速進(jìn)入并分布于腦組織中，透過率均略優(yōu)于合成冰片，結(jié)合艾片組小鼠腦組織中所含龍腦絕對值肯定大于合成冰片組，可推測艾片與合成冰片治療腦部疾病的作用可能會存在一定差異。但是這種藥效差異以及二者透過血腦屏障的作用機(jī)制，尤其對血腦屏障開放密切相關(guān)的P-糖蛋白通路的影響， 還有待于進(jìn)一步的研究。

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R285.5

： B

： 1001-1528（2014）01-0205-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.054

2013-01-15

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 （973 計(jì)劃） 項(xiàng)目 （2007CB512606）

田 徽 （1980—） ， 男， 副教授， 博士生， 研究方向： 中藥理論與應(yīng)用。 Tel：（0816）220065， E-mail： tianhui1009@126.com

*通信作者： 王 建 （1959—） ， 女， 教授， 博導(dǎo)， 研究方向： 臨床中藥學(xué)。 Tel： （028） 61800231， E-mail： jianwang08@163.com