痹祺膠囊提取物對 RAW 264.7 細胞模型的抗炎作用

張馨方， 王強松， 崔元璐*

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院， 天津 300193； 2.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學院， 天津 300462）

痹祺膠囊提取物對 RAW 264.7 細胞模型的抗炎作用

張馨方1，2， 王強松1， 崔元璐1*

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院， 天津 300193； 2.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學院， 天津 300462）

目的 通過比較研究痹祺膠囊 （馬錢子、黨參、丹參、 白術(shù)、 茯苓、 川芎、三七、地龍、 甘草、 牛膝） 不同溶劑提取物的抗炎作用，從而確定最佳提取溶劑。方法 3種溶劑提取痹祺膠囊，水、石油醚、正丁醇的提取物與脂多糖 （LPS） 刺激小鼠單核 /巨噬細胞 RAW264.7 共孵， 用酶聯(lián)免疫吸附法 （ELISA）、 Griess Reagent法檢測細胞分泌的腫瘤壞死因子 （ TNF-α） 和一氧化氮 （ NO） 的水平； 以實時定 量逆轉(zhuǎn)錄-聚合 酶鏈式 反應(yīng) （ Real-time RT-PCR） 檢測細胞炎癥相關(guān)指標白介素-6 （ IL-6）、 環(huán)氧合酶-2 （ COX-2 ） 、 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 （ iNOS） 、 TNF-α的 mRNA表 達水平， 比較 3 種提取物的抗炎作用。 結(jié)果 3 種提取物均能顯著抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞分泌 NO和 TNF-α， 其中水提取物的抑制作用最強， 且劑量依賴性最顯著。 在基因表達水平， 只有水提取物對 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞的IL-6、 COX-2、 iNOS 的 mRNA表達有顯著抑制作用。 結(jié)論 體外細胞藥理學實驗結(jié)果表明， 痹祺膠囊內(nèi)容物以水、 石油醚、正丁醇3種溶劑體系提取得到提取物均具有抗炎作用，但水提取物抗炎作用更顯著。

痹祺膠囊；提取工藝；巨噬細胞；脂多糖；抗炎

痹祺膠囊由馬錢子、黨參、丹參、白術(shù)、茯苓、川芎、三七、地龍、甘草、牛膝十味中藥組成，功能益氣養(yǎng)血、祛風除濕、活血止痛，用于氣血不足，風濕阻滯，肌肉關(guān)節(jié)酸痛，關(guān)節(jié)僵硬變形等。近年來藥理研究表明痹祺膠囊具有抗炎、消腫、 鎮(zhèn)痛及改善動脈血流等作用［1］。 痹祺膠囊主要用于中醫(yī) “痹癥” 范疇疾病的治療， 經(jīng)過多年臨床應(yīng)用，其療效得到了廣泛的認可。但痹祺膠囊是由中藥飲片粉碎得到的生藥粉直接灌裝膠囊制成，患者服用量偏大。未來考慮對藥材進行提取，得到提取物灌裝膠囊，以減少患者的服用量。但如何設(shè)計合理的提取工藝以確保其療效，是制劑工藝改進面臨的一個首要問題。本研究分別設(shè)計以水、石油醚、正丁醇作為溶劑提取痹祺膠囊內(nèi)容物藥粉，選擇水作為提取溶劑，主要考慮傳統(tǒng)中藥以水煎煮法獲得復(fù)方的有效成分，操作簡便，提取效率高，是中藥提取的傳統(tǒng)方法；石油醚極性較小，可以用于油脂性成分的抽提；正丁醇對極性較大的成分提取效果好。選擇這3種溶劑提取痹祺膠囊復(fù)方多種成分的代表性好。另外，隨著中藥用藥安全性要求的逐漸提高，明確中成藥的有效部位和治療作用的分子藥理學機制，也是亟待解決的問題。因此，有必要對痹祺膠囊不同溶劑體系提取的提取物，進行藥理活性比較研究，以期獲得最優(yōu)提取工藝。 本實驗采用脂多糖 （LPS） （1 mg/L） 刺激RAW264.7 細胞構(gòu)建的體外細胞炎癥模型， 比較研究痹祺膠囊不同提取工藝制備的提取物體外抗炎作用的差別，從而對痹祺膠囊未來制劑工藝改進的二次開發(fā)研究，提供數(shù)據(jù)支持。

1 實驗材料

1.1 試驗藥物 痹祺膠囊提取物的制備： 痹祺膠囊原藥粉末，由天津京萬紅藥業(yè)股份有限公司提供（批號為 301510）， 精確稱取 3 等份， 各 10 g， 分別以 150 mL蒸餾水、 正丁醇和石油醚 3 種溶劑室溫下超聲提取 30 min， 如此重復(fù)提取 3 次，合并 3次的提取物，過濾、回流濃縮、冷凍干燥即得。水、正丁醇、石油醚3種溶劑提取物的得率分別為25.9%、12.7%、 4.1%。 使用時精確稱取相應(yīng)質(zhì)量，以細胞培養(yǎng)基溶解痹祺膠囊水提取物配制成合適濃度， 石油醚和正丁醇提取物由 DMSO溶解，再用培養(yǎng)基稀釋， DMSO終質(zhì)量分數(shù)不超過0.1%，空白對照組也加入相同劑量的 DMSO溶液。0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 細胞株 小鼠單核/巨噬細胞株 RAW 264.7購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞庫。RAW264.7 細胞以含有 10% 熱滅活胎牛血清 （HIFBS） 的 DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)， 添加 100 U/mL的青霉素和 100 μg/m L的鏈霉素， 培養(yǎng)于 37 ℃、5%CO2、 飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。 細胞隔天換液，融合80%或以上時以無菌細胞刮刀刮下， 無菌一次性移液管吹打細胞呈單細胞懸液，接種于多孔培養(yǎng)板或傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 試 劑 與 儀 器 脂 多 糖 （ 美 國， Sigmaaldrich）， TNF-αELISA試劑盒 （ 美國 Invitrogen），UNIQ-10 柱式總 RNA提取試劑盒 （ 中國上海， 生工）， ImProm-Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （美國， Promega），SYBR Green 法 Real-time PCR試劑盒 （ 美國， Sigma-aldrich）。 CO2培養(yǎng)箱 （ 美 國， Thermo）， 多功能讀板機 （瑞士， TECAN）， 倒置相差顯微鏡 （日本， Nikon ）、 核 酸 蛋 白 分 析 儀-DU800 （ 美 國，Beckman Coulter）， 高速離心機-22R （ 美國， Beckman Coulter） ， 7500 型全自動熒光定量 PCR儀 （美國， ABI）。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥 設(shè)空白對照組， LPS 刺激模型組，痹祺膠囊水提取物組，痹祺膠囊石油醚提取物組，痹祺膠囊正丁醇提取物組?？瞻捉M只加入含5%HI-FBS 的無酚紅培養(yǎng)基； LPS 模型組加入含有1 mg/L脂多糖的 5%HI-FBS 無酚紅培基； 3 種提取物組在 LPS 模型組所用培養(yǎng)基中再加入不同質(zhì)量濃度的3種溶劑提取物，細胞增殖實驗結(jié)果顯示，提取物終質(zhì)量濃度小于 2 mg/L對細胞增殖無影響［2］（數(shù)據(jù)未列出）， 故在一氧化氮 （ NO） 和腫瘤壞死因子 （TNF-α） 的檢測實驗中均設(shè)置 3 個質(zhì)量濃度，提取物終質(zhì)量濃度分別為 0.25、 0.5、1 mg/L， 在 PCR 實 驗 中 只 設(shè) 置 終 質(zhì) 量 濃 度為1 mg/L。

2.2 對 LPS 刺激 RAW264.7 細胞分泌 NO、 TNF-α的影響 RAW264.7 細胞接種于 96 孔板中， 待細胞全部貼壁后， 各組按 “2.1” 項描述換入相應(yīng)的培養(yǎng)基。 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h， 取細胞培養(yǎng)上清液檢測RAW264.7 細胞分泌 NO［3］和 TNF-α的水平。

2.3 對 LPS 刺激 RAW264.7 細胞相關(guān)細胞因子mRNA表達的影響 RAW264.7 細胞接種于 6 孔板中，待細胞全部貼壁后，各組按 “分組與給藥”部分描述換入相應(yīng)的培養(yǎng)基。 繼續(xù)培養(yǎng) 6 h， 以UNIQ-10 柱法提取細胞總 mRNA，按 ImProm-Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作， 將其逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA， 得到的cDNA樣品開展 Real-time PCR［4］， 檢測白細胞介素-6 （IL-6） 、 環(huán)氧合酶-2 （ COX-2）、 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 （iNOS）、腫瘤壞死因子 （TNF-α） 的 mRNA表達水平， 引物序列見表1。

3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值 ±標準偏差表示， 使用 Origin Pro 7.5 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并做圖。 組間比較使用單因素方差分析 （One-Way ANOVA），以P＜0.05 或 P＜0.01 為具有統(tǒng)計學意義。

表 1 Real-time RT-PCR引物序列Tab.1 Real tim e RT-PCR oligo-nucleotide Primers

4 結(jié)果

4.1 痹祺膠囊提取物抑制 LPS 刺激的 RAW264.7細胞分 泌 NO 運用 Griess試劑法 檢 測 LPS 刺 激RAW264.7 細胞培養(yǎng)液中的 NO水平， 3 種不同溶劑提取物均能抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞分泌 NO （P＜0.01）。 其中， 水提物抑制作用最強，且劑量依賴性顯著；相比之下，石油醚和正丁醇的提取物抑制細胞分泌NO作用較弱，且提取物各質(zhì)量濃度的抑制作用無顯著性劑量依賴關(guān)系，結(jié)果見圖1。

圖1 痹祺膠囊水、 石油醚、 正丁醇提取物對 LPS刺激 RAW 264.7 細胞產(chǎn)生一氧化氮的影響 （n=6）Fig.1 Effects of Biqi CaPsules from water， Petroleum ether and n-butanol on the exPression of NO mediator in LPS-stimulated RAW 264.7 （n=6）

4.2 痹祺膠囊提取物抑制 LPS 刺激的 RAW264.7細胞分泌 TNF-α 以 ELISA法檢測不同溶劑提取物對 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞上清液中 TNF-α水平的影響，結(jié)果表明 （ 見圖 2）， 3 種痹祺膠囊提取物均能顯著抑制 LPS 刺激 RAW264.7 細胞產(chǎn)生TNF-α（P＜ 0.01）， 且均能表現(xiàn)出劑量依賴性，其中尤以痹祺膠囊水提物高劑量組 （1 mg/L） 抑制作用最顯著。

圖2 痹祺膠囊水、 石油醚、 正丁醇提取物對 LPS刺激 RAW 264.7 細胞分泌 TNF-α的影響 （n=6）Fig.2 Effects of Biqi CaPsules from water， Petroleum ether and n-butanol on the exPression of TNF-α mediator in LPS-stimulated RAW 264.7（n=6）

4.3 痹祺膠囊提取物對 LPS 刺激 RAW264.7 細胞炎癥相關(guān) 指 標 mRNA表達的影響 LPS 刺 激RAW264.7 細胞能使細胞內(nèi)相關(guān)炎癥因子的 mRNA表達水平顯著升高， 3 種提取物對 IL-6、COX-2 和iNOSmRNA的表達均有一定的抑制作用 （ 見圖3）， 但僅痹祺膠囊水提取物與模型組比較具有顯著性差異 （P＜0.05 或 P＜0.01）； 3 種痹祺膠囊提取物對 TNF-α基因表達的抑制作用不明顯。

圖 3 痹祺膠囊水、 石油醚、 正丁醇提取物對 LPS刺激 RAW 264.7 細胞內(nèi) IL-6 （ A） 、 COX-2 （ B） 、 iNOS（ C） 、 TNF-α（D） mRNA表達的影響 （n=6）Fig.3 Effects of Biqi CaPsules from water， Petroleum ether and n-butanol on themRNA exPression of IL-6 （ A） ， COX-2 （ B） ， iNOS（ C） ， TNF-α（ D） in LPS-stimulated RAW 264.7 （ n=6）

5 討論

痹祺膠囊是治療 “痹癥” 的要藥， 在治療風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等疾病方面已經(jīng)取得了很好的臨床療效，大量臨床觀察與動物藥理實驗表明痹祺膠囊具有止痛快、抗炎作用強、毒副作用小的優(yōu)勢［5］， 本實驗主要針對痹祺膠囊 3 種不同溶劑提取物的體外抗炎作用進行了研究。

以 LPS 刺激小鼠單核/巨噬細胞株 RAW264.7，可以誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生多種炎癥相關(guān)介質(zhì)和細胞因子［2］，例如分泌 NO，TNF-α，IL-6， COX-2 等。 以 LPS 刺激 RAW264.7 細胞作為體外炎癥模型［6-8］， 被廣泛用于抗炎藥物的篩選評價。其中NO作為眾多炎癥介質(zhì)中的重要因子之一，在調(diào)節(jié)多種生理功能方面起重要作用，例如血管擴張、神經(jīng)傳遞和炎癥應(yīng)答等［9-10］。 RAW264.7 細胞株經(jīng) LPS 刺激向細 胞 培 養(yǎng)液中釋放產(chǎn)生的NO， 其濃度可以用來評價炎癥反應(yīng)的強弱程度［11］。 痹祺膠囊 3 種溶劑提取物均有很強的抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞分泌 NO的作用，但是尤其以水提取物抑制作用最強，且劑量依賴性明顯，顯示出水提取工藝對痹祺膠囊中抗炎有效成分的提取效率最高。

TNF-α和 IL能誘導(dǎo)關(guān)節(jié)細胞 （ 軟骨細胞和滑膜細胞等）產(chǎn)生其它細胞因子、蛋白酶類、集落刺激因子和前列腺素等，在關(guān)節(jié)炎癥的引起、發(fā)生、 發(fā)展和治療過程中都有極 其重要 的作用［12］。TNF-α是其中最具有代表性的炎癥因子， 它參與和調(diào)控多條炎癥相關(guān)通路的開放與運行［13］。 檢測不同溶劑的痹祺膠囊提取物對 LPS 刺激的 RAW264.7細胞上清液中 TNF-α水平的影響， 能間接反映其抗炎作用的強弱。結(jié)果顯示，痹祺膠囊3種溶劑的提取物均可以抑制 RAW264.7 細胞分泌 TNF-α， 同時也顯示出抑制炎癥因子的基因表達，其中尤其以水提物的抑制作用最強，與正丁醇和石油醚提取物相比具有顯著優(yōu)勢，這也表明水提取工藝對痹祺膠囊中抗炎有效成分的提取效率最高，或者說痹祺膠囊中起抗炎作用的有效成分以水溶性成分為主。

以往對痹祺膠囊的研究主要在藥理和臨床療效觀察方面，幾乎沒有制備工藝相關(guān)的報道。而對痹祺膠囊中各中藥成分的提取工藝研究則大都只采用化學成分作為考察指標，缺乏提取物藥效學指標的考察和驗證。本實驗以水、石油醚和正丁醇3種具有代表性的溶劑提取痹祺膠囊有效成分， 以 LPS刺激 RAW264.7 細胞為炎癥模型， 檢測 3 種提取物給藥后對炎癥相關(guān)介質(zhì) NO、 TNF-α等的分泌與mRNA的表達情況， 初步篩選出水較其他兩種溶劑更適合作為痹祺膠囊的提取溶劑。這為今后痹祺膠囊制劑工藝改進的二次開發(fā)研究，提供數(shù)據(jù)支持。

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Anti-inflammatory effect of three extractions from Biqi CaPsules on LPS-stimulated RAW 264.7 macroPhages

ZHANG Xin-fang1，2， WANG Qiang-song1， CUIYuan-lu1*
（1.Institute of Traditional ChineseMedicine， Tianjin University of Traditional ChineseMedicine， Tianjin 300193， China； 2.Tianjin Vocational Collegeof Beioengineering， Tianjin 300462， China）

AIM To determine the best extraction of Biqi Capsules（ Strychni Semen，Codonopsis Radix，Salviaemiltiorrhizae Radix et Rhizome， Atractylodismacrocephalae Rhizoma， Poria， Chuanxiong Rhizoma， Notoginseng Radix et Rrhizoma， Pheretima， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Achyranthis bidentatae Radix） by different solvents， and to compare their anti-inflammatory effects.METHOD The anti-inflammatory action of aqueous，petroleum ether and n-butanol extracts to lipopolysaccharide（LPS） -stimulated mouse mononuclear macrophage cells line RAW 264.7 were compared in vitro.Production of nitric oxide（ NO） and tumor necrosis factor-alpha（ TNF-α） weremeasured by the Griess colorimetric method and Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay（ ELISA） ，respectively.ThemRNA expression levels of inducible nitric oxide synthase（iNOS）， cyclooxygenase（COX-2），TNF-α， and interleukin-6 （ IL-6） were detected by quantitative real-time RT-PCR.RESULTS Three extracts of Biqi Capsules significantly reduced the levels of NO and TNF-αproduction in LPS-stimulated RAW264.7 （ P＜0.01） ， and the effect of aqueous extract of Biqi Capsules had themost effective anti-inflammatory action than that of petroleum ether extract and n-butanol extract in the dose-dependentmanner.The results of real-time RT-PCR showed that iNOS， COX-2 and IL-6 mRNA expression decreased.CONCLUSION These results demonstrate that all three Biqi Capsule extracts have anti-inflammatory effects， with aqueous extract being themost effective.

Biqi Capsules； extraction； macrophage； lipopolysaccharide； anti-inflammatory

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0026-005

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.007

2013-02-04

教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃 （ NCET-09-0899）

張馨方 （1987—） ， 女 （ 滿族） ， 碩士生。 研究方向： 中藥學。 Tel： 15022721947， E-mail： xinfangZH2010@163.com

*通信作者： 崔元璐 （1972—） ， 男， 研究員， 主要從事中藥藥理學及中藥制劑學研究。 Tel：（022）59596170， E-mail： cuiyl@tju.edu.cn