Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化黨參的閃式提取工藝

楊炳川， 方應(yīng)權(quán)， 謝仲德

（重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校， 重慶 404020）

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化黨參的閃式提取工藝

楊炳川， 方應(yīng)權(quán)*， 謝仲德

（重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校， 重慶 404020）

目的 建立和優(yōu)化黨參炔苷的閃式提取工藝。 方法 采用 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)， 結(jié)合響應(yīng)面法， 以黨參炔苷得率為指標(biāo)考察影響閃式提取的主要因素， 選擇最佳工藝條件。 結(jié)果 閃式提取的最佳工藝為： 120 V工作電壓， 以16 倍 （V/m） 78%乙醇提取時(shí)間 128 s。 在上述條件下， 黨參炔苷平均得率為 0.090 3%， 這一結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值符合。結(jié)論 閃式提取法操作簡(jiǎn)便，節(jié)能高效，可用于黨參炔苷的提取。

閃式提??；黨參；黨參炔苷；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

黨 參 為 桔 梗 科 植 物 黨 參 Codonopsis pilosula （ Franch.）Nannf.、 紫 花 黨 參 Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta（ Nannf.） L.T.Shen 或川黨參 （ Codonopsis tangshen Oliv.）的干燥根［1］。 巫溪古稱大寧， 所產(chǎn)大寧黨參屬川黨參［2］。黨參性甘，平，歸脾、肺經(jīng)。具有健脾益肺，養(yǎng)血生津的功能［1］。 現(xiàn)代研究表明， 黨參含糖類、 揮發(fā)油、 皂苷及聚炔類等多種化合物，具有增強(qiáng)免疫力、擴(kuò)張血管、降壓、改善微循環(huán)、 增強(qiáng)造血功能等作用［3-5］。 黨參炔苷 （ lobetyolin） 為黨參的活性成分， 對(duì)乙醇造成的胃黏膜損傷具有很好的保護(hù)作用。不同產(chǎn)地的黨參均含有黨參炔苷，而與黨參配伍的中藥中未檢測(cè)到黨參炔苷，因此黨參炔苷具有很好的專屬性和特征性，可作為黨參藥材的特征指標(biāo)成分［5-7］。 黨參炔苷常用提取方法有滲漉法、 乙醇回流法和超聲提取法等［8-9］。 閃式提取法是一種操作簡(jiǎn)便， 節(jié)能高效的提取方法［10-11］， 本研究首次以 閃式提取法提取大寧黨參中的炔苷， 并以黨參炔苷得率為指標(biāo)， 采用 Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為合理開發(fā)大寧黨參提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

JHBE-50S 型中草藥閃式提取器 （西安太康生物科技有限公司）； Agilent1100 系列高效液相色譜儀； RE 52—86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）； SB 3200-超聲波提取器（上海必能信超聲有限公司）； 超純水儀 （上海優(yōu)普純水公司）； RE 52—86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）；Sartorius BS110S 分析天平 （ 北京賽多利天平有限公司） 。

大寧黨參 （產(chǎn)地： 巫溪縣夏布坪）， 由三峽中藥研究所付紹智教授鑒定為 Codonopsis tangshen Oliv.的根， 除去雜質(zhì)， 洗凈， 干燥， 備用［2］； 黨參炔苷對(duì)照品 （ 上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心， 純度 ＞98%）； 乙腈為色譜純； 其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 大寧黨參中黨參炔苷的閃式提取工藝 取干燥黨參粉碎制成粗粉 （20 目）， 精密稱取20 g粗粉置閃式提取罐內(nèi)，加入一定量的乙醇溶液提取， 工作電壓為 120 V。 提取液濾過，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液揮干溶劑，即得。閃式提取過程中的提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和用量根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)安排而定。

2.2 大寧黨參炔苷的測(cè)定方法 根據(jù)文獻(xiàn)方法［5，12］， 采用高效液相色譜 -紫外檢測(cè)法 （HPLC-UV） 測(cè)定黨參藥材和提取物中黨參炔苷的含有量。

色譜條件為色譜柱 Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 4.6mm， 5 μm）； 以乙腈-0.01%三氟乙酸 （20 ∶80） 為流動(dòng)相； 體積流量為1.0mL/min； 柱溫為 30 ℃， 檢測(cè)波長(zhǎng)為267 nm； 進(jìn)樣量 20 μL。 黨參炔苷進(jìn)樣量 （X） 在 0.16 ～3.20 μg內(nèi)與峰面積 （Y） 呈線性關(guān)系， Y=112 176X+ 84 587 （r=0.999 9）， 日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）均小于 2%， 黨參炔苷的平均回收率為 97.42%， RSD為1.42%， 供試品溶液在 12 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

2.3.1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取影響閃式提取工藝的三個(gè)因素，即提取時(shí)間（x1）、 乙醇體積分?jǐn)?shù) （x2） 和液料比 （x3） 為考察因素，根據(jù) Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理， 各因素設(shè)置 3 水平， 編碼為-， 0， +， 各因素和水平編碼及實(shí)際值見表 1， 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定并計(jì)算黨參炔苷得率，以得率平均值為指標(biāo) （Y）， 實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

表 1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素和水平

表 2 Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果

2.3.2 模型擬合與分 析 采 用 Design Expert 7.0.0 （ Stat-Ease Inc.Minneapolis） 軟件 對(duì) 考 察指標(biāo) （ Y） 和 3 個(gè)考察因素 （x1、 x2、 x3） 進(jìn)行回歸分析， 結(jié)果顯示指標(biāo)和因素之間符合二次二項(xiàng)式模型 （P=0.000 1）， 模型的失擬（ lack of fit） 檢驗(yàn)顯示 失 擬呈非顯 著 意義 （ P=0.749 4），表明模型擬合度高。對(duì)模型、一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)進(jìn)行方差分析 （表3）。 結(jié)果可見， 各因素的一次項(xiàng) （主要作用） 對(duì)提取得率的影響均呈統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著意義 （P＜0.01）， 比較 F值可見， 主次順序?yàn)椋?液料比 ＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的交互作用項(xiàng)（x2x3） 呈極顯著意義 （P=0.001 3）， 其余交換項(xiàng)對(duì)提取得率影響不顯著 （P＞0.05）。 各因素的二次項(xiàng)對(duì)閃式提取得率均呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義 （P＜0.05）。

表 3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析

在 P＜0.1 水平上拒絕無(wú)顯著相關(guān)的項(xiàng)目， 簡(jiǎn)化方程，得指標(biāo)與因素的模型方程為：

Y=-2.957+4.638 ×10-3x1+0.059 59x2+0.037 23x3-5.475 ×10-4x2x3-1.745 ×10-5-3.163+4.198 × 10-4

方差分析 顯 示， 模 型 P＜0.000 1， 具有極顯著意 義，校正決定系數(shù)=0.946 6， 表明該方程擬合程度好，失擬檢驗(yàn) P值為 0.895 0， 可見模型失擬不顯著［13］。

利用上述方程并結(jié)合 Design Expert 7.0.0 軟件整合計(jì)算渴求函數(shù) （ desirability function） 的 功能， 設(shè)各 因素權(quán)重為1， 得到考 察指標(biāo) （Y）、 即黨參 炔 苷 得率極值為0.090 8%， 各因素水平分別為： 提取時(shí)間 （x1） 128 s， 乙醇體積分?jǐn)?shù) （x2） 78%， 液料比 （x3） 16， 以此作為閃式提取法提取大寧黨參中黨參炔苷的最佳工藝條件。

2.3.3 驗(yàn)證最佳工藝條件 取大寧黨參粗粉 20 g， 按確定的最佳工藝閃式提取黨參炔苷， 按 “2.2” 項(xiàng)下條件測(cè)定， 平行操作3 份， 黨參炔苷得率平均值為 （0.090 3 ±0.003 7） %， 與模型預(yù)測(cè)值的偏差為 -0.55%。 可見模型預(yù)測(cè)性好， 確定的工藝具備可操作性和重復(fù)性。

2.4 與其他提取方法的比較 取同一批大寧黨參樣品， 根據(jù)文獻(xiàn)方法［8-9］， 采用超聲提取法和滲漉法提取大寧黨參中的炔苷，每種方法重復(fù)3次，與本研究確定的閃式提取法相比較，結(jié)果見表4。

表4 提取方法比較

3 討論

Box-Behnken 設(shè)計(jì) （BBD） 近年來在中藥提取、 制備和分析中應(yīng)用日益廣泛［14-15］。 本 研究建立了閃式提取法提取大寧黨參中黨參炔苷的方法， 采用 Box-Behnken 設(shè)計(jì)考察影響提取得率的主要因素：提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比，黨參炔苷得率與考察因素之間符合二次二項(xiàng)式模型，通過響應(yīng)面分析和渴求函數(shù)求極值的方法，確定了閃式提取的最佳工藝條件為將黨參藥材制成粗粉， 工作電壓 120 V， 16 倍量 （V/m） 75%乙醇提取 128 s， 模型預(yù)測(cè)得率為0.090 8%， 實(shí)際值為0.090 3%， 模型預(yù)測(cè)良好， 工藝條件操作性和重復(fù)性好。測(cè)定了上述工藝條件下黨參炔苷轉(zhuǎn)移率， 轉(zhuǎn)移率為 86.51%， 說明提取基本完全。 計(jì)算公式為：

轉(zhuǎn)移率 = （提取液中成分量/藥材中成分量） ×100%

研究中發(fā)現(xiàn)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，黨參炔苷的得率先增大后減小，其原因可能是因?yàn)辄h參炔苷結(jié)構(gòu)中含有炔鍵［8］， 在閃式提取高速剪切和攪拌［11］的條件下可能發(fā)生加成、氧化等反應(yīng)，導(dǎo)致得率反而下降。而乙醇體積分?jǐn)?shù)增大時(shí)也存在同樣的情況，黨參炔苷得率先增大后減小。在考察范圍內(nèi)，黨參炔苷得率隨著液料比的增大而增大，但預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)液料比超過16 ∶1時(shí)， 提取物中的雜質(zhì)明顯增多，且液料比增大也會(huì)直接導(dǎo)致溶劑消耗量增大，因此設(shè)定液料比的考察范圍為8 ～16 倍。

比較各種提取方法 （表4）， 滲漉法、 超聲法和閃式提取法得率相近，但滲漉法和超聲提取法時(shí)，藥材分別需要48 h 和 12 h 的浸泡過程， 在時(shí)間上遠(yuǎn)超過閃提法的 128 s。乙醇用量上， V滲漉法∶V超聲法∶V閃提法=0.52 ∶1.2 ∶1。 可見閃提法操作時(shí)間短，提取效率與傳統(tǒng)方法相當(dāng)，可用作提取黨參中的黨參炔苷。

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R284.2

： B

： 1001-1528（2014）05-1074-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.045

2013-10-14

重慶市教委自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （kt121805）

楊炳川 （1956—）， 男， 副主任藥師。 研究方向： 天然藥物成分提取分離。 Tel： 13709440178

*通信作者： 方應(yīng)權(quán) （1973—） ， 男， 碩士， 副教授。 研究方向： 中藥開發(fā)。 Tel： （0433） 58153404， E-mail： 862120258@qq.com