低氘水抑制宮頸癌Hela細胞增殖和侵襲能力的研究

張力+張瀚彬+陳淼++等

廣東醫(yī)學院中美腫瘤研究所，廣東東莞 523808

[摘要] 目的 探討培養(yǎng)基中氘濃度的下降對宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲能力的影響。 方法 用含不同氘濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細胞，分為150×10-6、100×10-6、75×10-6和50×10-6共4組，其中，氘濃度為150×10-6的培養(yǎng)基為對照組，其他為實驗組；用四甲基噻唑藍（MTT）法、劃痕實驗檢測隨著培養(yǎng)基中氘濃度下降，Hela細胞增殖和遷移侵襲力的變化；流式細胞術檢測含不同氘濃度的培養(yǎng)基對Hela細胞周期的影響；蛋白免疫印跡和免疫組化實驗檢測含不同氘濃度的培養(yǎng)基對Hela細胞腫瘤相關蛋白p21、Na+/K+-ATPase表達的影響。 結(jié)果 MTT實驗結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基中氘濃度的降低Hela細胞增殖得到明顯的抑制，其中氘濃度為50×10-6的培養(yǎng)基抑制效果最明顯，相同條件下與對照組相比在72 h抑制率達到39.54%（P < 0.01）；劃痕實驗可觀察到Hela細胞在氘濃度為75×10-6、50×10-6的培養(yǎng)基中細胞遷移能力得到明顯抑制（P < 0.05）；Hela細胞在氘濃度為75×10-6、50×10-6的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，流式細胞術檢測S期明顯低于對照組（P < 0.01）；Hela細胞腫瘤相關蛋白p21在氘濃度為100×10-6、75×10-6和50×10-6的培養(yǎng)基中的表達與對照組比較，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結(jié)論 培養(yǎng)基中氘濃度的下降對宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲能力有明顯的抑制作用。

[關鍵詞] 低氘水；Hela；增殖；p21蛋白

[中圖分類號] R739.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）03（c）-0020-06

Research of inhibition of deuterium-depleted water for cervical cancer Hela cell proliferation and invasiveness

ZHANG Li ZHANG Hanbin CHEN Miao WU Yongfu HUANG Haohai ZHU Baohua YANG Huiling

Sino′ America Cancer Research Institute， Guangdong Medical College， Guangdong Province， Dongguan 523808， China

[Abstract] Objective To examine the effects of the proliferation and invasiveness in Hela cell lines by the deuterium-depleted water （DDW）. Methods The Hela cell lines were cultured in the presence of media containing different concentrations of deuterium （150×10-6， 100×10-6， 75×10-6 and 50×10-6）， while the 150×10-6 concentration of deuterium was taken as the control group， the other concentrations of deuterium were taken as the experimental group. MTT and wound scratch assay were used to examine the effects of DDW on the proliferation and migration of Hela cells. Moreover， the flow cytometry was used to detect the effects of DDW on the cell cycle of Hela cell lines. Finally， the expression levels of p21 and Na+/K+-ATPase were assessed by using Western blot and immunohistochemistry. Results The proliferation of Hela cells was significantly suppressed when culturing in three concentrations of DDW （100×10-6， 75×10-6 and 50×10-6） medium， the inhibition effect was obvious in 50×10-6 concentration of DDW， the 72 h inhibition ratio was 39.54% （P < 0.01）. The result of wound scratch assay showed that the invasiveness ability of Hela cells was significantly decreased in 75×10-6 and 50×10-6 concentration of DDW （P < 0.05）. Cell cycle analysis revealed that DDW caused cell cycle arrest and decreased the amounts of cells in the S phase after 24 h cultivation in 75×10-6 and 50×10-6 concentration of DDW （P < 0.01）. Western blot suggested that compared with the control group， DDW （100×10-6， 75×10-6 and 50×10-6） could up-regulate the expression of p21 （P < 0.01）. Conclusion The decreased of deuterium concentration in the medium can significant inhibit the proliferation and invasiveness of Hela cells.

[Key words] Deuterium-depleted water； Hela cells； Proliferation； p21 protein

宮頸癌是全球女性惡性腫瘤中第3位最常見的癌癥，也是導致女性癌癥患者死亡的第4大原因，并占了近10%的新診斷癌癥病例和8%的癌癥死亡總數(shù)[1]。全球?qū)m頸癌發(fā)病率在1980年每年約378 000例，到2010年已增加到每年約454 000例[2]。據(jù)估計每年我國新發(fā)宮頸癌病例約100 000例，占世界子宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的1/5[3]。目前宮頸癌的主要治療手段是手術、放射治療和化學藥物治療。

在自然界中，水是由氕（H）和氘（D）兩種氫的非放射性穩(wěn)定同位素和氧組成的化合物。氘與氧組成的水稱為重水，天然水中，氘和氕的比率（D∶H）大約是1∶6600，即自然界水中氘的體積分數(shù)為0.0139%～0.0151%[4-8]。因此，把氘體積分數(shù)低于0.015%的水稱為低氘水（DDW）。由于氘對氕在質(zhì)量上相差約1倍以及C-D鍵比C-H鍵牢固不易斷裂，水中同位素氕和氘含量的變化會導致水的物理化學和核性質(zhì)顯著差異。有研究表明，氘能置換生物體內(nèi)的氕并蓄積下來，隨著生物體內(nèi)氘濃度的增加，氫鍵間交聯(lián)發(fā)生改變，從而使細胞質(zhì)剛性顯著增加，有絲分裂受阻滯[9-12]。飲用DDW可以預防疾病、延緩衰老、活化機體免疫細胞[13-14]。近年國外核醫(yī)學領域和水生理學領域?qū)DW在某些癌癥等疾病的輔助治療的應用研究有了重大突破[15-18]。本文中將比較多種含有不同濃度氘的培養(yǎng)基對Hela細胞株生長影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

DDW（體積分數(shù)為0.005%，50×10-6）購自上海奧特泉公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；宮頸癌細胞株Hela購自美國ATCC，并由中美腫瘤所保種；DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；PI染料購自北京索萊寶公司；核糖核酸酶A（RNaseA）購自Invitrogen；MTT試劑盒購自北京索萊寶公司；p21 Waf1/Cip1（12D1） Rabbit mAb購自Cell Signaling；β-actin（13E5） Rabbit mAb購自Cell Signaling；Alexa Flour 800 goat anti-rabbit lgG（H+L）購自Invitrogen；Na+/K+-ATPase ɑ（H-3） mouse monoclonal lgG2b購自Santa Cruz；免疫組化試劑UltraVision Quanto Detection System HRP Quanto & DAB Quanto購自Thermo Scientific；其他試劑均為進口分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組

宮頸癌Hela細胞培養(yǎng)于含有10% FBS的1640培養(yǎng)基中，置于含5%（體積分數(shù)）CO2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。DDW（100×10-6、75×10-6、50×10-6，實驗組）與普通超純水（150×10-6，對照組）按體積比分別配置成用于Hela培養(yǎng)的1640培養(yǎng)基。

1.3 MTT法檢測DDW對細胞增殖活性的影響

用不含血清的1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)Hela細胞24 h后，用含乙二胺四乙酸（EDTA）0.25%胰酶消化，計數(shù)，以5×103個細胞/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔分別加入100 μL含10%FBS普通1640培養(yǎng)基（150×10-6，對照組）或含不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）1640培養(yǎng)基（實驗組），各設3個復孔，置于37℃、5%（體積分數(shù)）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加100 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，選擇490 nm波長，測定各孔的光密度（OD）值。結(jié)果取3次實驗平均值。計算DDW對細胞的增殖抑制率。抑制率=（1-實驗組OD/對照組OD）×100%。

1.4 細胞劃痕實驗

按實驗“1.3”項下方法收集細胞加入6孔板中，密度為6×105個細胞/孔。用10%FBS普通1640培養(yǎng)基（150×10-6，對照組）及含不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640培養(yǎng)基（實驗組）進行培養(yǎng)12 h。等細胞貼壁完全后，用移液槍的10 μL無菌槍頭在各個孔內(nèi)輕劃一條直線，在同一放大倍數(shù)下測量直線寬度并做好記錄，作為0 h數(shù)據(jù)。48 h后，從培養(yǎng)箱中取出細胞放置在顯微鏡下觀察所劃直線寬度變化，并拍照，在同一放大倍數(shù)下測量直線寬度并做好記錄作為24 h數(shù)據(jù)。將實驗組（100×10-6、75×10-6、50×10-6） 0 h數(shù)據(jù)與24 h數(shù)據(jù)差值，分別和對照組（150×10-6） 0 h數(shù)據(jù)與24 h數(shù)據(jù)差值對比。分析DDW對細胞的侵襲能力影響差異是否有統(tǒng)計學意義。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期

按實驗“1.3”項下方法收集Hela細胞以1×105個細胞/mL的密度接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，分別加入含10%FBS的普通1640培養(yǎng)基（150×10-6，對照組）或不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640培養(yǎng)基（實驗組）培養(yǎng)24 h，用0.25%不含EDTA的胰酶消化并收集細胞。用70%乙醇固定，4℃過夜，PBS清洗1次，1000 r/min離心5 min，棄上清；PBS再清洗1次，1000 r/min離心5 min，棄上清；每管加入500 μL染色液（500 μL PBS+2.5 μL PI+2 μL RNaseA），37℃水浴避光染色30 min，經(jīng)60目尼龍網(wǎng)篩過濾，立即用流式細胞儀分析。計數(shù)1×104個細胞，觀察細胞周期各期的分布特征。

1.6 Western blot法檢測Hela細胞p21蛋白的表達水平

按實驗“1.3”項下方法收集Hela細胞并計數(shù)，以1×105個細胞/mL的密度接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿中，分別加入含10%FBS的普通1640培養(yǎng)基（150×10-6，對照組）或含不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640培養(yǎng)基（實驗組）培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入細胞裂解液RIPA 200 μL裂解，并加入蛋白酶混合抑制劑20 μL，置冰上30 min讓其充分裂解，細胞刮子收集細胞，4℃、10 000 r/min離心15 min，吸取上清液分裝置-80℃?zhèn)溆?。NanoDrop微量紫外分光光度計測定蛋白含量，各孔的蛋白上樣總量一致，均為100 μg。電泳濃縮膠80 V，50 min，分離膠110 V，150 min。經(jīng)過10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，110 V 500 mA轉(zhuǎn)膜120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。采用室溫含2.5%脫脂奶粉的PBST （400 mL PBS+40 μL 吐溫20） 封閉60 min，按抗體要求的比例加入兔抗p21一抗（1∶3000）、兔抗β-actin一抗 （1∶3000），4℃過夜，室溫復性1 h，PBST洗膜4次，10 min/次，按一定比例（1∶10000）加入相應的Alexa Flour 800 goat anti-rabbit lgG（H+L）二抗，室溫避光孵育120 min。PBST洗去未結(jié)合的二抗3 次，10 min/次，Western blot紅外熒光顯像儀顯影。

1.7 免疫組織化學LP法檢測p21、Na+/K+-ATPase蛋白表達變化

按實驗“1.3”項下方法將Hela細胞消化后，分別在6孔板中每孔平行加入6×105個細胞。用普通含10% FBS 1640普通培養(yǎng)基（150×10-6）及低氘濃度（50×10-6）的1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)24 h后，除去培養(yǎng)基，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，10%正常羊血清孵育，滴加一抗4℃孵育過夜，PBS緩沖液（Na2HPO4 8.1 mmol/L，KH2PO4 1.5 mmol/L，NaCl 137 mmol/L，2.7 mmol/L，pH 7.4）振蕩清洗后分別滴加二、三抗，DAB顯色，蘇木精復染。陽性信號呈棕色細顆粒狀。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低氘水對Hela細胞增殖的影響

含氘濃度為100×10-6、75×10-6、50×10-6的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h對Hela細胞的抑制率分別為16.01%、26.17%和33.39%，48 h的抑制率分別為7.98%、25.27%和34.5%，72 h的抑制率分別為11.42%、21.46%和39.54%。各實驗組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

表1 低氘水對Hela細胞增殖的影響（x±s，n = 6）

注：與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.2 低氘水對Hela細胞遷移侵襲能力的影響

含100×10-6、75×10-6、50×10-6 DDW的培養(yǎng)基（實驗組）培養(yǎng)48 h對Hela細胞的遷移侵襲能力有抑制作用，與對照組（150×10-6）相比，75×10-6、50×10-6 DDW的抑制作用較為明顯（P < 0.01）。見圖1。

*P < 0.05，**P < 0.01

圖1 低氘水對細胞遷移侵襲能力的影響

2.3 低氘水對Hela細胞周期的影響

從圖2可以看出，DDW對宮頸癌Hela細胞周期具有抑制作用，隨著培養(yǎng)基中氘濃度的降低，Hela細胞主要表現(xiàn)為G1、G2期靜止或略微增加，S期逐漸降低；其中，氘濃度為75、50 ppm的抑制作用較為明顯，S期明顯減少（P < 0.01），見表2。

表2 各組Hela細胞周期情況（%，x±s，n = 3）

注：與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.4 低氘水對p21蛋白的表達的影響

分別用含氘濃度100×10-6、75×10-6、50×10-6 1640培養(yǎng)基（實驗組）和氘濃度150×10-6的正常1640培養(yǎng)基（對照組）處理Hela細胞24 h后，Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)DDW能夠明顯上調(diào)宮頸癌Hela細胞中p21蛋白的表達（圖3）。Hela細胞中p21蛋白在氘濃度為100、75、50 ppm的培養(yǎng)基（實驗組）中表達灰度值分別為（0.717±0.037）、（0.979±0.082）、（1.146±0.087），與對照組（0.539±0.042）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

*P < 0.05，**P < 0.01

圖3 Western blot法檢測p21蛋白的表達

2.5 低氘水對p21、Na+/K+-ATPase蛋白表達的影響

分別用氘濃度為150×10-6普通1640培養(yǎng)基和氘濃度為50×10-6的1640培養(yǎng)基處理Hela細胞24 h后，免疫組化檢測p21、Na+/K+-ATPase蛋白表達變化。從圖4中可以看出，經(jīng)過染色后可以發(fā)現(xiàn)p21蛋白在氘濃度為50×10-6的1640培養(yǎng)基中的表達明顯高于氘濃度為150×10-6正常1640培養(yǎng)基；而Na+/K+-ATPase在氘濃度為50×10-6的1640培養(yǎng)基中的表達明顯低于氘濃度為150×10-6正常1640培養(yǎng)基。

3 討論

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，DDW可以抑制肺癌、鼻咽癌和肝癌腫瘤細胞的生長以及在延長癌癥患者生存期方面具有積極的作用[19-23]。然而目前尚未見低氘水對宮頸癌的作用研究的相關報道。本研究將Hela細胞用不同DDW濃度的培養(yǎng)基處理，用MTT法、劃痕實驗觀察到隨著培養(yǎng)基中氘濃度下降，Hela細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力得到明顯的抑制，在氘濃度為50×10-6的培養(yǎng)基，72 h的增殖抑制率達到39.54%（P < 0.01）。劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，DDW對宮頸癌細胞的侵襲能力具有抑制作用，同樣在50×10-6時差異性最明顯（P < 0.01）。Western blot和免疫組化檢測相關蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)DDW能選擇性上調(diào)Hela細胞中p21蛋白的表達水平，下調(diào)Na+/K+-ATPase的表達。p21waf基因是p53基因重要的下游基因之一，其表達產(chǎn)物p21蛋白是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白。p21可以和p53共同構成細胞周期G1檢查站。因DNA損傷后不經(jīng)過修復則無法通過G1檢查站，減少了受損DNA的復制和積累，從而發(fā)揮抑癌作用。Sultana等[24]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者對化療的敏感性是通過p53-Bax調(diào)節(jié)通路，誘導細胞凋亡而起作用；先期化療可以促進宮頸癌患者CD8+和CD4+陽性的T細胞、自然殺傷細胞誘導產(chǎn)生干擾素γ，通過免疫系統(tǒng)而起作用。Gy？觟ngyi等[25]證實，DDW能降低經(jīng)致癌源處理大鼠C-myc、Ha-ras和p53基因表達。本研究用流式細胞術檢測含不同氘濃度的培養(yǎng)基對Hela細胞周期的影響。隨著DDW氘濃度的降低，主要表現(xiàn)為G1、G2期逐漸增加，S期逐漸減少。這很可能是DDW選擇性抑制Hela宮頸癌細胞株增殖和轉(zhuǎn)移能力的分子機制之一，即通過p53介導，有效上調(diào)p21影響細胞的周期進程和凋亡，從而達到對腫瘤細胞的抑制作用。Na+/K+-ATPase是腫瘤組織異常增生的物質(zhì)基礎之一，與正常細胞相比，腫瘤細胞內(nèi)的Na+/K+-ATPase活性是顯著升高的。李春曉等[26]及Usta等[27]研究表明，抑制Na+/K+-ATPase活力可作為一種新的治療乳腺癌和肝癌的有效手段。本研究Western blot和免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)DDW處理的Hela細胞，Na+/K+-ATPase蛋白明顯下調(diào)。這些結(jié)果說明，降低細胞生長環(huán)境中的氘體積濃度，可以抑制Hela宮頸癌細胞株的增殖和轉(zhuǎn)移能力，DDW具有選擇性抗腫瘤的靶向生物效應。

人類乳頭狀瘤病毒（HPV）和吸煙是宮頸癌的兩大危險因素，HPV感染是最主要的因素，幾乎所有的宮頸癌都與HPV感染有關[28]。宮頸癌的主要治療手段是手術、放射治療和化學藥物治療。手術治療主要適用于早期宮頸癌（ⅠA～ⅡA期）患者。雖然傳統(tǒng)上認為，宮頸癌對化療藥物不敏感，治療方法以手術和放療為主，但是大量的腫瘤細胞學研究進展和臨床實踐證實，對于亞臨床和微小的轉(zhuǎn)移灶手術和放療并不能完全控制和消除。因此，作為治療癌癥有效方法之一的化療在宮頸癌的綜合治療中的地位也越來越受到重視。近年來，研究表明，癌細胞增長機制與氘原子有很大的關系，通過降低體內(nèi)氘的濃度，可以抑制體內(nèi)癌細胞的增長。因此，DDW作為新型無毒副作用抗癌輔助治療劑在腫瘤治療中將具有重要應用前景。

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[25] Gy？觟ngyi Z，Somlyai G. Deuterium depletion can decrease the expression of C-myc Ha-ras and p53 gene in carcinogen-treated mice [J]. In vivo（Athens，Greece），2000，14（3）：437-439.

[26] 李春曉，李偉，王薇，等.P21蛋白在不同級別宮頸組織中的表達及其與高危HPV感染相關性的研究[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2009，18（1）：44-48.

[27] Usta J，Hachem Y，El-Rifai O，et al. Fragrance chemicals lyral and lilial decrease viability of HaCat cells' by increasing free radical production and lowering intracellular ATP level： protection by antioxidants [J]. Toxicology in vitro ： An International Journal Published in Association with BIBRA，2013，27（1）：339-348.

[28] Schiffman M，Castle PE，Jeronimo J，et al. Human papillomavirus and cervical cancer [J]. Lancet，2007，370（9590）：890-907.

（收稿日期：2013-12-03 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2013-12-03 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2013-12-03 本文編輯：程 銘）