桑青枯雷爾氏菌MR111的gsp I和gsp J基因的克隆與序列分析

摘 要：gsp I和gsp J兩個(gè)蛋白可能參與青枯雷爾氏菌II型分泌系統(tǒng)周質(zhì)復(fù)合體的形成。為進(jìn)一步研究青枯雷爾氏菌基因間的互作，以桑青枯雷爾氏菌MR111為材料，對(duì)MR111的gsp I和gsp J基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和測(cè)序，分別獲得了gsp I基因（391 bp）和gsp J基因（567 bp）序列；序列編碼蛋白均含典型的該類基因的功能性結(jié)構(gòu)，N端均以疏水氨基酸亮氨酸（L）和丙氨酸（A）最多，具分泌型信號(hào)肽特性，與其他青枯雷爾氏菌的同源基因的一致性在94%以上；以gsp I和gsp J基因聯(lián)合矩陣進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)幾種青枯雷爾氏菌基因聚合后，再與其他雷爾氏菌屬基因相聚合。

關(guān)鍵詞：桑青枯雷爾氏菌MR111；II型分泌系統(tǒng)；gsp基因；序列分析

中圖分類號(hào)：S127 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2014）17-0001-03

Acquisition and Sequence Analysis of gsp I and gsp J Gene of Ralstonia solanacearum MR111 in Mulberry

KONG Wei-qing

（Shaanxi Key Sericultural Laboratory， Ankang College， Ankang 725099， PRC）

Abstract：The bacterial wilt （ Ralstonia solanacearum ） is one of the major diseases in mulberry. Two proteins gsp I and gsp J may be involved in the formation of periplasmic complex of Ralstonia solanacearum type II secretion system. The genes gsp I and gsp J of strain MR111 with 391 bp and 567 bp，respectively，have been obtained by PCR amplication and sequence. The sequence-encoded protein contains functional structures of this gene type with the secretory signal peptide composed mainly by leucine and alanine in the N-end of the two genes. The identity between these two genes and other homologous genes from R. solanacearum is both above 94%. The results of clustering analysis with gsp I and gsp J gene combined matrix show that all genes from R. solanacearum have been clustered in one branch，and then would be clustered with the genes from Ralstonia sp. and R. Pickettii in this study.

Key words：Ralstonia solanacearum MR111； type II secretion system； gsp gene； sequence analysis

收稿日期：2014-06-30

基金項(xiàng)目：安康學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科研究項(xiàng)目（zdxkzx007）

作者簡(jiǎn)介：孔衛(wèi)青（1980-），女，山東成武縣人，副教授，主要從事蠶桑生物技術(shù)研究。

植物病原細(xì)菌通過(guò)不同的分泌途徑將其毒性因子和酶類分泌到胞外，與宿主蛋白進(jìn)行互作[1]。Ⅱ型分泌系統(tǒng)（T2SS）是革蘭氏陰性菌中的常規(guī)代謝途徑，通過(guò)向細(xì)胞外分泌胞外酶、蛋白酶、毒素、毒性因子以及降解植物細(xì)胞壁的半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶等，破壞寄主細(xì)胞，影響和阻礙植物體內(nèi)的水分運(yùn)輸，引起組織壞死和病害的發(fā)生[2-3]，而其突變會(huì)造成許多蛋白分泌的缺乏[4-5] ，因此其在細(xì)菌的致病過(guò)程中同樣具有重要的作用。該分泌系統(tǒng)的中心是分泌途徑轉(zhuǎn)膜蛋白（general secrety pathway transmembrane protein，GSP）基因簇，共12～15種蛋白[6]，命名為A-O，S。

植物青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的一種危害嚴(yán)重的細(xì)菌性維管束病害，可危害數(shù)百種植物，在茄科、葫蘆科、豆科和煙草等經(jīng)濟(jì)作物上最為常見。青枯雷爾氏菌的Ⅱ型分泌系統(tǒng)中心由12個(gè)蛋白Gsp C-N組成，其中Gsp I和Gsp J兩個(gè)蛋白可能存在相互作用，并與Gsp G、Gsp H和Gsp K一起在周質(zhì)中形成復(fù)合體，與可固定在各種固體表面并將蛋白分泌出胞外的pilin有一定的序列相似性，因此被稱為“假菌毛”[7-8]。試驗(yàn)以桑青枯雷爾氏菌為研究對(duì)象，獲得了桑青枯雷爾式菌的gsp I和gsp J基因，為基因間的互作及青枯雷爾氏菌II型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和泌出機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株MR111由陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。Taq DNA聚合酶、dNTPs等購(gòu)于寶生物工程有限公司。TTC固體培養(yǎng)基和 SPA液體培養(yǎng)基均自行配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及DNA提取 （1）活化菌株：挑取保存的桑青枯雷爾氏菌在TTC固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后在劃線培養(yǎng)平板上挑選單菌落在SPA液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。（2）提取菌株DNA：按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取活化培養(yǎng)的桑青枯雷爾式菌基因組DNA，并通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 菌株DNA gsp I和gsp J基因的擴(kuò)增與測(cè)序 根據(jù)NCBI中青枯雷爾氏菌已登錄的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，

gsp I的引物序列為gsp IF：5’-GCCATGAGCCGAGCCA-3’；gsp IR：5’- CGCACGCGGTCAGAAG-3’，gsp J的引物序列分別為gsp JF：5’- CCCTGCTGCCCAACGA-3’；gsp JR：5’- CGTCGCATCATGTCAG-3’。因?yàn)榍嗫堇谞柺暇鷊sp基因的GC含量偏高，所以在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，需在反應(yīng)體系中加入5%二甲基亞砜

（DMSO），以降低模板二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的影響。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55℃退火45 s、72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)后用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，送上海生工武漢測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 gsp I和gsp J基因序列的分析 通過(guò)NCBI在線BLAST軟件比對(duì)獲得的桑青枯雷爾氏菌MR111的gsp I和gsp J基因序列，采用BoxShade3.21（http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html ）對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行描影和印刷；并通過(guò)Target P 1.1軟件預(yù)測(cè)gsp I和gsp J基因的蛋白信號(hào)肽類型[9]，在NPS （http：//npsa-pbil.

ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl page= /NPSA/npsa_compo.html）上分析信號(hào)肽氨基酸組成，通過(guò)在線CDD預(yù)測(cè)基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)域，并下載相關(guān)序列，進(jìn)行多序列比對(duì)和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑青枯雷爾氏菌基因組DNA的提取

凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1，采用上述試驗(yàn)方法提取桑青枯雷爾氏菌基因組DNA，得到單一條帶，無(wú)雜帶，這說(shuō)明試驗(yàn)所用的DNA提取方法切實(shí)可行，可用于下一步試驗(yàn)研究。

2.2 gsp I和gsp J基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序

由圖2可知，2個(gè)引物對(duì)分別擴(kuò)增到gsp I和gsp J基因，其中g(shù)sp J的片段大小約500 bp，gsp I的片段大小在500～750 bp之間。對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，gsp I基因獲得長(zhǎng)391 bp的序列（自起始密碼子下游37 bp至終止密碼子后10 bp），gsp J基因獲得567 bp的序列（位于21～587 bp間），Genbank登錄號(hào)分別為KM055498

和KM055499。

2.3 gsp I和gsp J基因結(jié)構(gòu)分析

從圖3中可以看出，gsp I編碼的氨基酸含典型的、具有高度保守性的T2SI（pfam02501）和gsp I（TIGR01707）結(jié)構(gòu)，gsp J基因的25～188位氨基酸為T2SS系統(tǒng)的組分gsp J的典型結(jié)構(gòu)Pul J（COG4795）。通過(guò)Target P 1.1軟件預(yù)測(cè)到gsp I和gsp J的蛋白信號(hào)肽均為分泌型，分別位于所得氨基酸序列的5～27和3～24 位，且含該類蛋白保守的IV_pilin_GFxxxE（TIGR02532，6～11位，4～9位）結(jié)構(gòu)。對(duì)信號(hào)肽氨基酸組成分析的結(jié)果顯示，2個(gè)信號(hào)肽的氨基酸組成很相似，均以疏水氨基酸亮氨酸（L）和丙氨酸（A）最多（表1）。

2.4 基于gsp I和gsp J基因的多序列比對(duì)與聚類分析

由圖4可知，gsp I基因與其它青枯雷爾氏菌的同源區(qū)域的一致性在98%以上，與皮氏羅爾斯頓氏菌

（R. pickettii 12D和R. pickettii OR214）和雷爾氏菌屬（Ralstonia sp.47FAA和Ralstonia sp.AU12-08）的相似性在90%左右，與伯克氏菌屬（Cupriavidus sp.SK-3）的相似性在80%左右，與伯克霍爾氏菌（Burkholderia sp.）的相似性在70%及以下；gsp J基因與其它青枯雷爾氏菌的同源區(qū)域的一致性在94%以上，與皮氏羅爾斯頓氏菌和雷爾氏菌屬的相似性在90%左右，與伯克氏菌屬的相似性約70%，與伯克霍爾氏菌的相似性小于60%；所有基因均含N末端分泌型信號(hào)肽及IV_pilin_GFxxxE結(jié)構(gòu)。

通過(guò)MEGA5.0以gsp I和gsp J基因的聯(lián)合矩陣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]，結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出，3個(gè)來(lái)源于青枯雷爾氏菌的基因聚合一起，再與羅爾斯頓氏菌和雷爾氏菌屬聚合在一起，基因序列相似性較高的種屬優(yōu)先聚合在一起，而相似性較低的伯克氏菌和伯克霍爾氏菌位于最遠(yuǎn)分支。

3 結(jié)論與討論

T2S分泌的多種胞外毒性蛋白是導(dǎo)致寄主植物萎蔫的重要因素，gsp基因簇作為T2S分泌系統(tǒng)的中心，在青枯菌的致病過(guò)程中起著十分重要的作用[11-12]。該研究獲得了桑青枯雷爾氏菌的gsp I和gsp J基因序列，其編碼的蛋白均含有T2SS系統(tǒng)蛋白的功能結(jié)構(gòu)域、典型的分泌型信號(hào)肽序列和IV_pilin_GFxxxE結(jié)構(gòu)，信號(hào)肽的氨基酸組成與劉雅婷等[13]應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析的青枯雷爾氏菌基因組中的分泌型信號(hào)肽的氨基酸組成青枯類似，均以疏水氨基酸亮氨酸（L）和丙氨酸（A）最多。

Bouley等[14]研究發(fā)現(xiàn)Erwinia屬的1個(gè)種產(chǎn)生的胞外蛋白不能被另一種的分泌系統(tǒng)分泌到胞外，即T2S具有細(xì)菌種的專一性。該研究通過(guò)BLAST分析和多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，gsp I和gsp J基因與青枯雷爾氏菌同源區(qū)域的一致性在94%以上，與皮氏羅爾斯頓氏菌和雷爾氏菌屬的相似性在90%左右，與伯克氏菌和伯克霍爾氏菌相似性在70%以下，這與不同來(lái)源序列進(jìn)行聚類分析的結(jié)果相一致，同時(shí)與T2S具有的細(xì)菌種的專一性相一致。

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（責(zé)任編輯：成 平）