腺病毒疫苗研究進(jìn)展

王芃，周建光

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850

腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，相對分子質(zhì)量為1.5×108，直徑約為95 nm，是已知最大和最復(fù)雜的無包膜DNA病毒之一。每個腺病毒均由外部的衣殼蛋白和內(nèi)部的核心蛋白組成。核心蛋白包括蛋白Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ，它們與病毒基因組結(jié)合；末端蛋白TP與病毒DNA的5'端共價(jià)結(jié)合；圍繞著病毒核心的是病毒的衣殼，它是由7種蛋白（Ⅱ、Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ）通過非共價(jià)相互作用形成的二十面體對稱結(jié)構(gòu)，其中240個三聚六鄰體（蛋白Ⅱ）是該20面體的主要組成蛋白。人類的腺病毒目前已鑒定出53個血清型，根據(jù)它們的血凝反應(yīng)、對嚙齒類動物的致瘤性、DNA的同源性和基因組的結(jié)構(gòu)，分為A、B、C、D、E、F、G亞屬，B亞屬又分為B1和B2組[1]。各個亞屬的腺病毒的致病性是不同的，B1、C和E亞屬引起呼吸道感染，B2亞屬引起腎臟和泌尿道的感染，F(xiàn)亞屬引起胃腸炎，D亞屬的部分血清型與流行性角膜結(jié)膜炎有關(guān)。

1 國內(nèi)外腺病毒疫苗研究進(jìn)展

1.1 國外研究進(jìn)展

在近50年的時間里，腺病毒是美軍現(xiàn)役軍人尤其是基層受訓(xùn)官兵重癥呼吸道疾病的主要病原體，而其中4型和7型腺病毒是主要的感染血清型。鑒于此，1971～1996年，美國國防部聯(lián)合國家衛(wèi)生署和Wyeth公司開發(fā)了口服4型和7型腺病毒疫苗，經(jīng)胃腸給藥途徑可以激發(fā)受試者血清抗體，多年接種結(jié)果證實(shí)該疫苗是安全的，沒有觀察到病毒間的交叉反應(yīng)，而且該疫苗項(xiàng)目的接種實(shí)施在軍隊(duì)中顯著降低了腺病毒的致病和死亡人數(shù)。然而自從該疫苗接種項(xiàng)目結(jié)束后，腺病毒造成的死亡人數(shù)又重新回升，因此2011年腺病毒疫苗接種項(xiàng)目又重新啟動[2-3]。對4型和7型腺病毒的疫苗株和原型株的基因組測序、生物信息學(xué)分析和比對已經(jīng)完成[4-6]。基因組的進(jìn)化分析表明，E屬4型腺病毒的原型株在進(jìn)化樹上與黑猩猩腺病毒有著較近的親緣關(guān)系，而與其他已知腺病毒的親緣性較遠(yuǎn)，它可能起源于一系列由黑猩猩傳染到人的人畜共患病事件；4型腺病毒疫苗株的基因組與原型株相差不大，有6個位點(diǎn)的非配對和4個位點(diǎn)的插入缺失，7型腺病毒疫苗株和原型株相比有611個位點(diǎn)非配對和130個位點(diǎn)插入缺失。

4型和7型腺病毒疫苗的安全性已在大量美軍人群中得以驗(yàn)證，研究者又對它們作為外源抗原呈遞載體進(jìn)行了嘗試。最初將它們用來表達(dá)乙肝病毒抗原，將包含乙肝抗原表位gp27和p24的表達(dá)盒子插入腺病毒的末端序列區(qū)，在A549細(xì)胞系中這些乙肝抗原得到了較好的表達(dá)，將表達(dá)乙肝抗原的重組7型腺病毒對狗進(jìn)行免疫后，獲得了針對乙肝抗原和7型腺病毒的較高的血清陽轉(zhuǎn)率[7]，說明用這2種疫苗株表達(dá)外源抗原的思路是可行的。隨后針對在人群中具有較快傳播速率和較高致死率的流感病毒H5N1，將其凝血素基因HA替換并插入4型腺病毒疫苗的E3區(qū)，得到了重組腺病毒流感疫苗Ad4-H5-Vtn，經(jīng)小鼠鼻飼免疫后可引發(fā)特異性的體液和細(xì)胞免疫，并在致死劑量的H5N1攻擊小鼠時對動物起到了保護(hù)作用[8]。隨后，研究者對該疫苗進(jìn)行了臨床Ⅰ期試驗(yàn)，將Ad4-H5-Vtn進(jìn)行了間隔56 d的3次口服免疫，最后受試者接受了90 μg滅活H5N1疫苗的肌肉注射加強(qiáng)免疫，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明口服高滴度Ad4-H5-Vtn的受試人群血清全部轉(zhuǎn)為抗HA陽性，說明通過口服該疫苗可以增強(qiáng)HA抗體的產(chǎn)生，克服現(xiàn)有滅活流感病毒疫苗免疫效果不佳的缺陷[9]。

1.2 國內(nèi)研究進(jìn)展

在我國的流行病學(xué)調(diào)研中，腺病毒在人群尤其是少年兒童中引發(fā)的感染主要為急性呼吸道感染疾病和肺炎，我國流行的腺病毒肺炎多數(shù)由3型及7型腺病毒引起，并且臨床上7型重于3型。近年來，周榮研究團(tuán)隊(duì)對3型和7型腺病毒疫苗的構(gòu)建做了一系列嘗試。首先，他們構(gòu)建了E1區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型3型腺病毒，又構(gòu)建了可以表達(dá)E1蛋白的HEp2細(xì)胞系HEp-2/E1，將E1缺陷的3型腺病毒轉(zhuǎn)染到HEp-2/E1中，出現(xiàn)了典型的病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），并觀察到了報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)[10]。然后，他們運(yùn)用細(xì)菌的同源重組機(jī)制，將全長3型腺病毒構(gòu)建在質(zhì)粒上，使其可以在大腸桿菌中穩(wěn)定存在，并可以在體外通過同源重組或傳統(tǒng)的基因克隆的方法方便地實(shí)現(xiàn)對3型腺病毒基因組的改造，通過這樣的方法將GFP基因插入腺病毒的E3區(qū)，證明GFP可以表達(dá)，將這種重組3型腺病毒通過肌肉注射、灌胃和鼻飼三種途徑免疫小鼠，均可以在小鼠體內(nèi)引發(fā)針對eGFP的特異抗體[11]。這2項(xiàng)研究證明了3型腺病毒作為減毒疫苗和外源抗原呈現(xiàn)載體的可能性。為了研制3型和7型雙價(jià)腺病毒疫苗，周榮等通過生物信息學(xué)方法預(yù)測了3型和7型腺病毒的位于六鄰體高變區(qū)（HVR）的各4個中和表位，并構(gòu)建了8種嵌合型腺病毒載體，為雙價(jià)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)，并表明3型腺病毒的六鄰體高變區(qū)是病原體表位呈現(xiàn)的良好靶點(diǎn)[12]。隨后研究者將手足口病毒EV71衣殼蛋白上的15個氨基酸的表位SP70整合到3型腺病毒的六鄰體的高變區(qū)上，動物實(shí)驗(yàn)表明SP70重組腺病毒可以引發(fā)高滴度的IgG抗體，并使動物對EV71病毒具有保護(hù)作用[13]。以上研究結(jié)果表明，我國在3型和7型腺病毒疫苗的研究上已有一定深度，并在積極拓展其在抗原呈遞載體中的作用。

2 以腺病毒為載體的疫苗

2.1 腺病毒作為抗原呈遞載體的優(yōu)勢

腺病毒本身既可作為疫苗，也可作為外源基因遞送載體。腺病毒作為基因遞送載體的優(yōu)勢包括：①宿主范圍廣，對人致病性低，不整合到染色體中，無插入致突變性；②對增殖和非增殖細(xì)胞都可以感染；③腺病毒重組載體的構(gòu)建和在懸浮細(xì)胞中的大規(guī)模培養(yǎng)已有較成熟的技術(shù)路線，而且成本低廉，病毒滴度高[14-15]；④與人類基因組同源；⑤在不同的劑型配方下，腺病毒載體疫苗可在4℃液體緩沖液中保存[16]，或以凍干粉形式存在1年以上[17]，而新近研究出的熱穩(wěn)定技術(shù)可以使腺病毒載體在高達(dá)45℃的室溫下保存6個月而其侵染活性少有下降[18]；⑥腺病毒自身具有免疫佐劑的功能，可以激發(fā)機(jī)體天然免疫反應(yīng)[19]，因此更加易于操作并能夠降低生產(chǎn)成本；⑦腺病毒載體疫苗可以有多種給藥途徑[20-23]，它可以侵染不同類型的細(xì)胞和組織，可以侵染分化和未分化細(xì)胞，甚至包括抗原提呈細(xì)胞[24]。

5型腺病毒是常見的用于疫苗構(gòu)建和基因治療的載體，基于5型腺病毒重組載體的研究經(jīng)歷了大致3代的完善。第一代腺病毒載體是將E1或E1和E3片段同時缺失，該類型腺病毒可容納高達(dá)8 kb的外源基因，是目前各種腺病毒載體中應(yīng)用最廣的；第二代腺病毒載體是在第一代缺失E1或E3基因的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將E2和E4基因缺失掉，從而降低載體的毒性，增加其外源基因的裝載容量，提高其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，但E2或E4區(qū)編碼的蛋白對細(xì)胞有害，從而難以建立反式提供E2或E4區(qū)編碼蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株，導(dǎo)致重組病毒的制備比較困難，因此限制了其應(yīng)用；第三代腺病毒載體是輔助病毒依賴性的腺病毒載體（HDAd），它除了保留有病毒必需的順式作用元件外，其余幾乎所有的病毒編碼序列都缺失掉了。盡管第二代和第三代的腺病毒載體避免了抗載體免疫反應(yīng)，并且具有更優(yōu)的免疫效果，但它們在大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用上還存在很多困難。

2.2 腺病毒載體存在的主要問題和解決方案

腺病毒用于疫苗構(gòu)建時面臨的最大問題就是預(yù)存免疫（pre-existing immunity）的存在，即由于5型腺病毒在環(huán)境中很常見，人群中容易產(chǎn)生抗腺病毒的免疫反應(yīng)，而這將會極大地降低腺病毒載體疫苗在人體中的效價(jià)。人們想出了很多策略來克服預(yù)存免疫的問題，這些策略包括兩大類：一類是化學(xué)法，即用聚乙二醇（PEG）等化學(xué)試劑包裹腺病毒，屏蔽其抗原表位，從而逃逸宿主的免疫作用，但此類方法難以獲得高滴度的病毒，在實(shí)際應(yīng)用時有較大難度；另一類就是采用基因工程的方法對腺病毒進(jìn)行修飾，這些方法主要包括構(gòu)建嵌合體修飾的5型腺病毒衣殼、構(gòu)建嵌合型的腺病毒、將基于5型腺病毒的疫苗完全替換為其他稀有的（來自人類或非人類的）腺病毒血清型。為了應(yīng)對人體已有的免疫原性，出現(xiàn)了一批5型腺病毒載體的替代品，包括基于稀有血清型人腺病毒（如Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49、Ad50等）和非人類腺病毒載體如大猩猩Ads、牛Ad3、狗Ad2、豬Ad3等。但有數(shù)據(jù)表明，不管是來源于稀有人血清型的腺病毒載體還是大猩猩的腺病毒載體，其所帶的外源基因引發(fā)的特異性抗體反應(yīng)強(qiáng)度均顯著低于由5型腺病毒載體[25-27]攜帶所激發(fā)的免疫反應(yīng)。并且，由于已感染5型腺病毒而存在的特異的CD4+和CD8+T細(xì)胞對于大猩猩重組腺病毒疫苗效價(jià)的發(fā)揮仍有不利的影響[28-29]。

2.3 將外源抗原呈現(xiàn)在腺病毒衣殼的研究進(jìn)展

六鄰體是腺病毒衣殼中含量最高的蛋白，也被認(rèn)為是中和抗體的主要靶點(diǎn)。在克服預(yù)存免疫的策略中，很多都是針對六鄰體進(jìn)行設(shè)計(jì)的。最初的設(shè)計(jì)通過將5型腺病毒的六鄰體基因替換為3型腺病毒的六鄰體，該嵌合型腺病毒可以在293細(xì)胞中進(jìn)行包裝復(fù)制，并且用其感染小鼠后可以避免5型腺病毒預(yù)存免疫的影響，但這種嵌合型5型腺病毒的缺點(diǎn)在于與野生型相比它的復(fù)制速率降低，而且病毒滴度下降了一個數(shù)量級[30]。在六鄰體蛋白三聚體結(jié)構(gòu)的塔尖區(qū)域中有7個HVR，包含型特異性表位。針對此，設(shè)計(jì)了一種新型的5型腺病毒嵌合型載體，其中位于5型腺病毒六鄰體的7個HVR被相應(yīng)的來自罕見血清型腺病毒Ad48的HVR所代替，這種HVR嵌合型的5型腺病毒載體可進(jìn)行高滴度的包裝并在體外穩(wěn)定傳代；在裸鼠和恒河猴的實(shí)驗(yàn)中，用這種新型嵌合型載體表達(dá)猴免疫缺陷病毒（SIV）的Gag抗原與母本腺病毒載體相比具有相似的免疫原性，而且在高水平的抗5型腺病毒免疫預(yù)存存在時，沒有觀察到嵌合型載體的外源抗原免疫原性下降，然而母本腺病毒載體的抗原免疫原性則被抑制了。該研究證明構(gòu)建六鄰體HVR區(qū)的嵌合體腺病毒載體是克服預(yù)存免疫的有效方法[31]。

五鄰體是腺病毒衣殼的重要組成部分，它們組成了衣殼的頂角并與六鄰體和纖毛蛋白相互作用。五鄰體的2個高變的環(huán)區(qū)暴露于衣殼表面，在不同的腺病毒血清型中，一個稱為高變區(qū)1（HRV1 loop），另外一個因具有與腺病毒次級受體整合素結(jié)合的RGD motif而被稱為RGD loop，不同血清型腺病毒的HVR1和RGD loop的長度都有明顯的變化。實(shí)驗(yàn)證明五鄰體上的這些環(huán)區(qū)的表位是除六鄰體外又一個有重要意義的靶點(diǎn)，對這些區(qū)域進(jìn)行修飾，可以改變腺病毒的組織嗜性[32]。

腺病毒的12根纖毛的近端在二十面體腺病毒的十二頂點(diǎn)處插入五鄰體基座，其遠(yuǎn)端纖毛突起形成球狀結(jié)構(gòu)域，該纖突位點(diǎn)是與細(xì)胞受體的主要作用位點(diǎn)。有研究證明，經(jīng)免疫接種和自然免疫獲得的5型腺病毒的中和抗體同時靶定于六鄰體和纖毛上，對免疫接種小鼠、免疫接種人群和自然暴露人群的血清實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針對腺病毒宿主產(chǎn)生的中和抗體中很大一部分是針對六鄰體的，但也有一部分是靶向纖毛的。鑒于此，研究者將5型腺病毒的六鄰體7個HVR區(qū)和纖突區(qū)都替換為黑猩猩腺病毒AdC68的相應(yīng)基因片段，由此構(gòu)建的新型嵌合型5型腺病毒載體經(jīng)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，幾乎可以完全逃逸5型腺病毒特異的中和抗體[33]。為進(jìn)一步探索將腺病毒纖毛蛋白作為抗原展示位點(diǎn)的可行性，研究者將銅綠假單胞菌外膜蛋白OprF的14個氨基酸的第8表位Epi8展示在5型腺病毒的5個不同的纖毛位點(diǎn)（loopCD、loopDE、loopFG、loopHI、纖毛的C端）上，以及六鄰體第5 HVR的環(huán)區(qū)，并與將全長OprF表達(dá)在5型腺病毒上的重組載體相比較。將這些疫苗候選株肌肉注射免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建于loopFG和loopHI的腺病毒疫苗候選株可以激發(fā)最強(qiáng)的抗OprF的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且在5型腺病毒預(yù)存免疫存在時，基于loopFG和loopHI的腺病毒疫苗株依然可引發(fā)對銅綠假單胞菌的免疫保護(hù)作用[34]，這說明將抗原表位整合在腺病毒的纖毛區(qū)是一種可行的疫苗設(shè)計(jì)策略。

以六鄰體、五鄰體和纖毛作為修飾靶點(diǎn)構(gòu)建疫苗候選株雖然得到了較好的體內(nèi)和體外的免疫效果，但囿于這些位點(diǎn)臨近區(qū)域的序列和結(jié)構(gòu)保守性，因此只能展示最大不超過100個氨基酸殘基的線性表位。近年來的研究表明，用腺病毒衣殼上的輔助小蛋白Ⅸ作為展示平臺，可以表達(dá)1000個氨基酸殘基的外源抗原。蛋白Ⅸ在腺病毒的每個殼面存在12個拷貝，可穩(wěn)定六鄰體蛋白間的相互作用，是病毒包裝的必需成分。研究者將單純皰疹病毒胸苷激酶HSV-TK聯(lián)合螢光素酶構(gòu)建在腺病毒的蛋白Ⅸ區(qū)，通過正電子發(fā)射斷層顯像技術(shù)（PET），在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了螢光素酶的表達(dá)[35]。然后，又有研究者將比較大的肽段如單鏈抗體（scFV）和單域抗體（sdAB）表達(dá)于腺病毒蛋白Ⅸ的C端，從而實(shí)現(xiàn)了腺病毒的重定位，但該研究者指出，在scFV表達(dá)時，由于蛋白無法正確折疊會影響其功能的發(fā)揮[36]。在用于疫苗的研究方面，研究者將泡沫病毒（FV）的包膜蛋白gp70與5型腺病毒的蛋白Ⅸ相融合，使gp70不僅可以呈現(xiàn)在病毒載體表面，并且可在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)它的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種將呈現(xiàn)和體內(nèi)表達(dá)相結(jié)合的疫苗設(shè)計(jì)，可以使受試小鼠中和抗體滴度和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)[37]。

綜上所述，六鄰體的HVR區(qū)是引發(fā)腺病毒型特異性中和抗體結(jié)合的主要靶點(diǎn)，在針對腺病毒的預(yù)存免疫進(jìn)行應(yīng)對策略和構(gòu)建多價(jià)腺病毒疫苗時，對該區(qū)域的基因修飾是不二選擇；五鄰體的2個高變區(qū)HVR1 loop和RGD loop，以及纖毛的HI loop和C端是進(jìn)行抗原表位展示的理想靶點(diǎn)；在插入多肽抗原和分子較大的外源蛋白時可以嘗試輔助蛋白Ⅸ位點(diǎn)。有研究者將流感病毒血凝素HA表位分別整合在5型腺病毒載體衣殼的六鄰體HVR5區(qū)、五鄰體的RGD loop、纖突的HI loop和蛋白Ⅸ的C端構(gòu)建了疫苗候選株，通過用等量的病毒顆粒（會生成不同HA表位拷貝數(shù)）和不同量的病毒顆粒（生成等量的HA拷貝數(shù)）對3種不同品系的小鼠進(jìn)行免疫接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不管是何種病毒量，也不管是何種品系的小鼠，表達(dá)在纖突上的HA表位都具有最好的體液免疫和細(xì)胞免疫效果[38]。該研究結(jié)果說明插入腺病毒衣殼蛋白的抗原表位引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)弱不一定取決于所在衣殼蛋白區(qū)域的拷貝數(shù)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)才能最終說明實(shí)際的免疫效果。

3 結(jié)語

腺病毒自身作為疫苗和作為疫苗載體都有很高的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值。但預(yù)存免疫的存在、病毒本身毒性降低的同時實(shí)現(xiàn)外源基因插入量的擴(kuò)大，以及大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)這3個因素都是限制其實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的主要問題。目前對腺病毒衣殼蛋白的修飾是腺病毒疫苗構(gòu)建的主要策略，通過了解衣殼蛋白的基因嵌入靶點(diǎn)的特性，并結(jié)合外源抗原和表位的特點(diǎn)，通過合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，相信腺病毒將會成為十分有前途的疫苗和抗原呈遞載體。

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