色譜技術在天然活性物分離分析中的應用

任其龍， 董新艷， 鮑宗必

(1.浙江大學化學工程與生物工程學系生物質化工教育部重點實驗室，浙江杭州310027;2.浙江大學寧波理工學院生物與化學工程分院，浙江寧波315100)

1 循環(huán)高效液相色譜技術分離純化復雜生物源的復合糖

當前，糖生物學領域亟須建立糖標準品庫，盡管許多低聚糖已能通過化學合成方法獲得，但一些具有重要生理活性的復合糖仍難以合成制備。為解決這一問題，美國印第安納大學伯明頓分校的Novotny等［1］采用循環(huán)高效液相色譜技術從多種天然產物中分離純化復合糖。循環(huán)高效液相色譜由2根色譜短柱和1個十通閥組成，十通閥將待分離組分交替循環(huán)輸入2根色譜柱進行循環(huán)分離，通過連續(xù)的循環(huán)操作方式實現(xiàn)模擬長柱的色譜分離效果，獲得了比傳統(tǒng)長色譜柱更高的分離效率。在此之前該方法尚未用于復雜生物活性物質的分離。他們應用此方法通過親水性色譜柱Amide-80有效分離了海藻低聚糖混合物以及糖蛋白中N-聚糖混合物，并得到純度＞98%的低聚糖及聚糖同分異構體，如棉子糖和松三糖、3種高甘露糖型聚糖異構體。

2 液相色譜-串聯(lián)質譜多反應監(jiān)測法定量分析低聚糖

因缺少標樣，不同構型的低聚糖常難以做定量分析。雖然三重四極桿串聯(lián)質譜多反應監(jiān)測技術(multiple reaction monitoring，MRM)常用于定量分析復雜混合物中低含量物質，但四極桿質譜的質量檢測范圍有限，因此MRM很少用于定量分析復雜易變的大分子低聚糖(Mr=5000 Da)等生物分子。美國加州大學的Lebrilla等［2］報道了一種應用液相色譜-串聯(lián)質譜MRM法定量分析低聚糖的方法。通過對離子源源內條件的優(yōu)化來提高低聚糖二級質譜母離子的豐度，同時通過對母離子的源內碰撞誘導解離技術研究選擇最佳的特征碎片離子對，以得到最佳靈敏度。實驗時需選擇至少兩個離子對用于定量和定性分析，這些離子對對應單電荷的單糖、雙糖和三糖離子。該方法的檢出限在fmol水平，定量范圍跨越5個數(shù)量級。僅采用7種低聚糖標樣即可用于測定人乳中所有種類的低聚糖，根據響應因子來計算不同結構低聚糖的絕對量和總低聚糖量。

3 在線加氫反應結合二維氣相色譜分離脂肪酸甲酯

動植物油脂中的脂肪酸包括飽和、單不飽和及多不飽和脂肪酸，且相同不飽和度的不飽和脂肪酸又有多種同分異構體，成分非常復雜。脂肪酸的單體分離分析具有很大的難度。美國馬里蘭大學帕克分校的Delmonte等［3］報道了一種二維氣相色譜分離脂肪酸甲酯的新方法。他們采用兩個長短不同的強極性離子液體毛細管柱SLB-IL111分離脂肪酸甲酯，該色譜柱對具有不同雙鍵數(shù)及不同雙鍵位置、構型的脂肪酸甲酯具有較高的分離選擇性。此外，將涂覆鈀的毛細管置于上述二維色譜之間，以氫氣為載氣，不飽和脂肪酸在毛細管內經加氫還原生成飽和脂肪酸，還原產物再進入第二維色譜柱進行分離。該方法與常規(guī)的二維氣相色譜不同，并不是通過改變兩柱溫度和極性來實現(xiàn)分離，而是在二維色譜間引入化學反應來改變待分析物質的分子結構，從而增強脂肪酸甲酯的分離效果。因此選擇兩個相同的色譜柱便可對復雜混合樣品(如脂肪酸甲酯混合標準品、鯡魚油中脂肪酸甲酯等)進行色譜分離。

4 不飽和脂肪酸碳碳雙鍵位置的確定

不飽和脂肪酸具有多種雙鍵位置異構體和構型異構體，且不飽和脂肪酸的生物活性及物理化學性質主要取決于其碳碳雙鍵的位置及數(shù)目，因此對不同雙鍵位置異構及構型異構體結構的準確鑒定具有重要的意義。質譜法因高靈敏性和選擇性且能提供詳細的結構信息而成為不飽和脂肪酸結構鑒定的最有效方法之一。然而，由于低能碰撞誘導解離過程產生的碎片離子通常不能明確雙鍵位置，因此僅靠傳統(tǒng)的串聯(lián)質譜法難以有效確定脂肪酸的雙鍵位置。有效的解決方法是在質譜分析前，通過化學衍生化方法對碳碳雙鍵進行標記，并通過衍生物的質譜圖來鑒定雙鍵位置。以下是兩個實例。

(1)銀離子色譜/在線臭氧氧化反應/質譜聯(lián)用鑒定共軛亞油酸異構體 加拿大阿爾伯塔大學的Curtis課題組［4］采用一種新穎的銀離子色譜/在線臭氧氧化反應/質譜(Ag+-LC/O3-MS)方法鑒定共軛亞油酸異構體。從銀離子色譜柱流出的含共軛亞油酸異構體的流動相進入一個富含臭氧的滲透性微孔反應管，其中的臭氧由管壁外滲入管內，將共軛亞油酸中的碳碳雙鍵氧化斷裂生成醛。該臭氧氧化產物直接進入大氣壓光電離源(APPI)進行質譜分析，通過分析醛及相應丟失的甲醇碎片離子可直接確定雙鍵位置。這種在線臭氧反應器可以直接連接HPLC和MS，對分析復雜脂類混合物提供多維信息。采用該方法不僅能通過質譜圖確定共軛亞油酸位置異構體，而且還能通過銀離子色譜的洗脫順序確定共軛亞油酸雙鍵構型異構體。他們用這一方法快速直接地確定了復雜脂肪酸混合物如牛奶脂肪、乳酸菌脂肪中的共軛亞油酸異構體。

(2)利用Paternò-Büchi反應耦合質譜鑒定脂肪酸中雙鍵位置 美國普渡大學的Xia教授等［5］報道了一種通過Paternò-Büchi反應結合串聯(lián)質譜鑒定不飽和脂肪酸碳碳雙鍵位置的新方法。Paternò-Büchi反應是在紫外激發(fā)下，將醛或酮的羰基活化生成自由基，再進一步和脂肪酸碳碳雙鍵反應生成氧雜環(huán)丁烷。采用三重四極桿線性離子阱質譜儀檢測，反應產物經碰撞活化促進逆向Paternò-Büchi反應，生成新的烯和酮，并產生能反映母體分子的碎片離子，從而確定不飽和脂肪酸的碳碳雙鍵位置。他們應用此方法有效鑒定了油酸、亞油酸、卵磷脂混合物、釀酒酵母中脂肪酸中的雙鍵位置。該方法可靈敏分析fmol量級的脂肪酸及復雜脂類混合物。此方法無需對質譜儀進行調整，常規(guī)實驗設備即可滿足在線Paternò-Büchi反應。不足的是，副反應的存在使得復雜脂類混合物的質譜圖非常復雜，降低了檢測的靈敏度，增加了結構分析的難度。將在線Paternò-Büchi反應和色譜分離相結合或許可解決這一問題。

［1］ Alley W R，Mann B F，Hruska V，et al.Anal Chem，2013，85:10408

［2］ Hong Q，Ruhaak L R，Totten S M，et al.Anal Chem，2014，86:2640

［3］ Delmonte P，F(xiàn)ardin-Kia A R，Rader J I.Anal Chem，2013，85:1517

［4］ Sun C，Black B A，Zhao Y Y，et al.Anal Chem，2013，85:7345

［5］ Ma X，Xia Y.Angew Chem Int Ed，2014，53:2592