O1群霍亂弧菌PFGE分子分型和菌株流行能力關系研究

陳愛平，楊勁松，李曲文，徐海濱，王靈嵐，鄭金鳳，嚴延生

福建省自1962年發(fā)生埃爾托型霍亂弧菌(EVC)引起的霍亂以來，疫情起伏不定，先后發(fā)生了幾次較大流行。首次為1962-1964年，流行優(yōu)勢血清型為O1群小川；第2次為1978-1989年，流行優(yōu)勢血清型先為1978年O1群小川型，后轉為稻葉型，流行時間持續(xù)近10年；第3次1994-2000年，流行優(yōu)勢血清型為O1群小川；2005年我省又發(fā)生了O1群稻葉的霍亂流行，疫情僅限于2005年；在福建省50年的霍亂流行過程中病原和流行特征都發(fā)生著改變。為闡明福建省不同時期、地域、不同血清群霍亂分離菌株間的遺傳聯(lián)系和遺傳多樣性，我們選擇福建省1962-2005年代表性霍亂弧菌，運用脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術進行分子分型，從細菌全基因組水平探索霍亂弧菌在福建省傳播及流行規(guī)律；同時結合流行病學資料，根據(jù)疫情流行持續(xù)時間、相關疫情病例數(shù)等，分析不同PFGE型(簇)的霍亂菌株的流行能力。

1 材料方法

1.1實驗用菌株 選擇1962-2005年福建省歷次霍亂流行，病人中分離保存的菌種77株；包括3次大流行的菌株(1962-1964年、 1978-1989年， 1994-2000年)、2005年菌株和2001-2003年散發(fā)病例的菌株；實驗用菌株均經(jīng)過血清學重新復核鑒定為O1群霍亂弧菌。菌株信息見圖1。

1.2PFGE實驗方法 根據(jù) PulseNet USA(美國CDC)網(wǎng)絡實驗室推薦的標準方法，經(jīng)國家CDC實驗優(yōu)化條件的基礎上進行PFGE實驗[1]。采用NotI限制性內切酶對實驗菌株進行酶切，標準菌株H9812采用XbaI限制性內切酶消化，主要的電泳參數(shù)為電壓梯度6 V/cm，電泳夾角120°，電泳溫度14 ℃；電泳參數(shù)：2 s～10 s，13 h, 20 s～25 s ,6 h(ctxA基因陰性菌株在電泳液中加硫脲，終濃度為50 μmol/L)。

1.3數(shù)據(jù)分析 PFGE圖像導入BioNumerics(version 6.0，Applied Maths，Inc)軟件包進行處理，選擇Dice相關系數(shù)和UPGMA方法，tolerance設置為1.5%。

1.4試劑儀器 Seakem Gold Agarose PFGE 級瓊脂糖購自Lonza公司，XbaⅠ和NotⅠ限制性內切酶以及蛋白酶K購自美國NEB公司，BIO-RAD公司的Basic電泳儀、Gel Doc XR+讀膠儀、CHEF MAPPER脈沖場凝膠電泳儀，BioMerieux Vitek公司的DENSIMAT細菌濁度儀。

2 結 果

2.177株霍亂弧菌PFGE分子分型結果 77株1962-2005年霍亂弧菌用NotⅠ酶切并進行脈沖場電泳后，DNA片段可得到較好地分離，可見大小不一的電泳條帶，分子量從20～690 kb；菌株條帶數(shù)目在21～26之間。利用Bionumerics軟件的Cluster analysis模塊進行聚類分析，菌株間條帶相似度在75.3%～100%之間；按照100%的相似度可將菌株酶切圖譜分為61個PFGE型，其中P1型有6株，P13、P14和P57型各有3株，其余各型為1-2株。根據(jù)TENOVER原則[2]，只有1-3條帶差異的菌株在遺傳上可能有緊密相關性，按照90%的相似度將部分菌株酶切圖譜劃為同一個簇，可得到5個主要的PFGE簇(G1-G5)。見圖1。

圖177株霍亂弧菌PFGE分型結果

Fig.1NotI-digestedPFGEpatternsof77V.choleraeO1serogroupisolates

2.277株霍亂弧菌PFGE簇不同流行時期分布 第1次流行的菌株以G5 PFGE簇為主(6/9)，同時存在G4和G1 PFGE簇；第2次流行的菌株以G1和G4 PFGE簇為主(18/24,6/24),第3次流行的菌株以G3和G4 PFGE簇為主(11/30,10/30)，2005年流行的菌株以G2為主(6/6)，2001-2003年散發(fā)的菌株沒有優(yōu)勢的PFGE簇，具體見表1。

表1 77株1962-2005年霍亂弧菌PFGE 簇不同流行時期分布情況

2.352株小川血清型PFGE分子分型結果 52株小川型霍亂弧菌，按照100%的相似度可將菌株酶切圖譜分為47個PFGE型。按照90%的相似度將部分菌株酶切圖譜劃為同一個簇，可得到4個主要的PFGE簇，命名為G1(o)-G4(o)，o是小川型(Ogawa)的第一個字母；具體見圖2。

2.4小川型PFGE 簇不同流行時期的分布情況 1962-1964年流行的菌株以G4(o)PFGE簇為主(7/9)；1978年流行的菌株以G3(o)PFGE簇為主(6/8)；1994-2000年流行的菌株以G2(o)PFGE簇為主(14/29)；1994-2000年屬于其它型別的小川型菌株有9/29；2001-2003散發(fā)的小川型菌株沒有優(yōu)勢PFGE簇；具體見表2。

2.5稻葉血清型PFGE分子分型結果 25株稻葉型霍亂弧菌按照100%的相似度可將菌株酶切圖譜分為15個PFGE型。按照90%的相似度將部分菌株酶切圖譜劃為同一個簇，可得到2個主要的PFGE簇，命名為G1(i)-G2(i)，i是稻葉型(Inaba)的第一個字母；具體見圖3。1979-1989年的菌株屬于G1(i) PFGE簇(14/14)，2005年的菌株屬于G2(i)PFGE簇(6/6)；其余年份散發(fā)的稻葉型菌株沒有優(yōu)勢的PFGE簇；具體見圖3。

圖252株小川血清型PFGE分子分型結果

Fig.2PFGEpatternsof52V.choleraeOgawaserotypestrains

表2 52株小川型霍亂弧菌PFGE簇不同流行時期分布情況

3 討 論

隨著脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型技術的標準化以及PulseNet監(jiān)測網(wǎng)絡的建立，越來越多的公共實驗室逐漸利用該技術平臺進行各種細菌性病原體監(jiān)測。我們對1962-2005代表性的O1群霍亂病人分離株進行PFGE分子分型，結果發(fā)現(xiàn)，按照100%的相似度可將77株菌株酶切圖譜分為61個PFGE型，沒有集中優(yōu)勢的PFGE型別。PFGE分子分型針對的是全細菌的基因組，對于同一次暴發(fā)流行的菌株，理論上菌株的基因組應該表現(xiàn)為100%的相似度；但是針對長時間跨年度流行的分離株以及實驗室長期保存的菌株(特別是以保種半固體方式保存的霍亂菌株)，因為菌株在長時間流行傳播和保存過程可能產生基因變異，即使是有遺傳相關性的菌株PFGE分型也不一定表現(xiàn)為100%的相似度；但是這種變異一般不會產生大的基因組變異。根據(jù)TENOVE原則[1]，PFGE基因型別只有1-3條帶差異的菌株在遺傳上可能有緊密相關性，實驗結果按照90%的相似度將大部分菌株酶切圖譜劃分為5個主要的PFGE簇G1-G5，實際上歸于同一個簇的菌株大部分是同一次流行的菌株；散發(fā)的菌株沒有顯示優(yōu)勢的簇，表現(xiàn)為各自不同的PFGE型別，提示散發(fā)菌株沒有遺傳上的相關性。因此對于PFGE分子分型的結果分析要結合收集菌株的流行病學背景資料、研究菌株的時間跨度和菌種的保存方式等選擇適當?shù)南嗨贫冗M行聚類，更能客觀、準確地反映菌株之間的相關性。

圖325株稻葉型PFGE分子分型結果

Fig.3PFGEpatternsof25V.choleraeInabaserotypestrains

從1962-2005年福建省霍亂菌株PFGE簇不同流行時期的分布情況可見，前3次流行的菌株既有上一次流行簇的延續(xù)，又有新的優(yōu)勢簇的出現(xiàn)；說明前3次流行的菌株在遺傳上有關聯(lián)性，但是在長時間流行過程中產生基因變異出現(xiàn)新的優(yōu)勢簇。相同的優(yōu)勢簇分布于福建省各個地區(qū)，提示福建省各地區(qū)間的霍亂流行在傳播上有相關性。

福建以小川型為優(yōu)勢血清型的霍亂流行時期有1962-1964、1978和1994-2000年[1]；各個流行時期均有各自優(yōu)勢的PFGE簇，分別為G4(o)、G3(o)、G2(o)。小川型為優(yōu)勢血清型的3次流行，均造成較多的病例數(shù)(均>1500例)，但是從流行持續(xù)的時間來看1994-2000年明顯超過1962-1964年和1978年，推測G2(o) PFGE簇的小川型菌株在引起霍亂流行時間長度能力上要強于G3(o)和G4(o)簇。另外，1994-2000年小川型菌株比其它流行時期的小川型菌株基因組更具有多樣性，可能原因是由于該次流行的時間跨度達10年之久，在長時間的流行過程中菌株產生了基因變異，特別是到了流行后期；而實際上歸于其它PFGE型別的9株菌株，有8株是1998-2000年流行后期的菌株。

福建以稻葉為優(yōu)勢血清型的霍亂流行時期有1979-1989和2005年；1979-1989年稻葉型流行了將近10年的時間，總發(fā)病數(shù)為22292例，2005年稻葉型引發(fā)的疫情僅限于當年，發(fā)病數(shù)310；從疫情的延續(xù)時間、發(fā)病規(guī)模和引發(fā)的病例數(shù)進行比較，1979-1989年都明顯超過2005年；1979-1989年的菌株均歸于G1(i) PFGE簇，2005年的菌株均歸于G2(i) PFGE簇；可以推測G1(i) PFGE簇的稻葉型菌株具有引起長時間、大規(guī)?；魜y流行的能力；G2(i) PFGE簇的菌株在流行能力上明顯較弱。

本文將O1群霍亂弧菌PFGE分子分型的結果和流行病學的背景資料相結合，對不同PFGE簇(型)菌株在流行時間長短、引發(fā)流行規(guī)模的能力等方面，進行初步探索，為評估將來霍亂疫情分離株對流行趨勢的可能影響積累實驗室研究本底資料。

參考文獻：

[1]Cooper KL, Luey CKY, Bird M, et al. Development and validation of a PulseNet standardized pulsed-field gel electrophoresis protocol for subtyping ofVibriocholerae[J]. Foodborne Pathog Dis, 2006, 3(1): 51-58. DOI: 10.1089/fpd.2006.3.51

[2]Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing[J]. J Clin Microbiol, 1995, 33(9): 2233-2239.