豬帶絳蟲重組抗原研究進(jìn)展

周必英

豬帶絳蟲(Taeniasolium,Ts)屬絳蟲綱(Class cestode)，其成蟲寄生于人的小腸。幼蟲豬囊尾蚴(cysticercus cellulosae)寄生于人或豬等中間宿主體內(nèi)(多見于心臟、腦、眼、肌肉)。人因生食或半生食含幼蟲的豬肉而感染豬帶絳蟲病成為終宿主，排出蟲卵，造成與之接觸的人/豬感染囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)，俗稱囊蟲病(Cysticercosis)。豬囊蟲病與人絳蟲病相互傳播，交叉感染，形成人畜間惡性循環(huán)，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，而且嚴(yán)重危害人類健康，特別是侵害腦部引起腦囊蟲病，致死致殘率極高。因此，豬帶絳蟲病和囊蟲病的診斷和防治顯得尤為重要，許多學(xué)者借助于新興的分子生物學(xué)方法，對Ts早期診斷和免疫防治用的重組抗原開展了廣泛研究，取得了較大進(jìn)展。本文就Ts六鉤蚴、囊尾蚴、成蟲階段重要重組抗原的研究進(jìn)展作一介紹。

1 Ts六鉤蚴重組抗原45 W和18 ku

Gauci等[1-4]成功克隆出豬帶絳蟲六鉤蚴TSO45W和TSOL18基因， TSO45W基因?qū)俣嗷蚣易澹辽儆?個成員組成，每一基因由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，可通過交替剪切(alternative splicing)形成A、B、C3種轉(zhuǎn)錄本，其中B型轉(zhuǎn)錄本的含量比較豐富，而45W-4B在同型轉(zhuǎn)錄本中同源性最低(80%)，但該基因在不同蟲株間和不同克隆間高度保守。TSOL18由579 bp組成，含有390 bp的ORF，5'端有15 bp的SD序列，信號肽序列位于3′端170 bp的非翻譯區(qū)內(nèi)，編碼130個氨基酸，分子質(zhì)量14.7 ku。同時，發(fā)現(xiàn)其編碼序列與帶科其他絳蟲相應(yīng)保護(hù)性抗原有很高的同源性，而且它們的編碼蛋白都含有與宿主免疫內(nèi)分泌密切相關(guān)的纖連蛋白Ⅲ型(FnⅢ)結(jié)構(gòu)域。因此，推測TSO45W-4B和TSOL18基因可能在六鉤蚴入侵宿主階段起重要作用，其編碼的蛋白可以作為一種重組疫苗來預(yù)防豬囊蟲病。

王福梅等[5]將200 μg TSO45W-4B重組抗原加206佐劑肌注免疫仔豬，在免疫后1月用25 000枚豬帶絳蟲卵攻擊，攻擊后3月發(fā)現(xiàn)免疫豬減蟲率為95%，保護(hù)率為33%，血清IgG在2～8 w升高，免疫后55 d達(dá)較高水平，外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率在攻擊后10 d開始升高，并保持較長時間。駱學(xué)農(nóng)等[6]將200 μg TSO45W-4B重組抗原肌注免疫50 d齡健康家豬，21 d后加強免疫1次，加強免疫后7 d用25 000枚豬帶絳蟲卵攻擊，攻擊后93 d保護(hù)率為97.0%，加206佐劑保護(hù)率為98.4%。方強等[7-8]將100 μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1/TSO45W-4B肌肉注射免疫4周齡昆明小鼠，免疫組化證實TSO45-4B基因可在質(zhì)粒注射部位肌肉組織的肌纖維內(nèi)得到高效表達(dá)。余招鋒等[9]將TSO45W-4B基因克隆至pGEM-3Z，構(gòu)建pGEM-3Z-4B，再亞克隆至轉(zhuǎn)移載體pVL1393，構(gòu)建pVL1393-4B，然后將pVL1393-4B與BmNPV病毒共轉(zhuǎn)染，獲得重組家蠶桿狀病毒BmNPV-4B，用該重組病毒感染Bm細(xì)胞，收集細(xì)胞上清，SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)重組病毒可表達(dá)分子量為16 ku的蛋白。

2 Ts囊尾蚴重組抗原cC1和AgB

王慶敏等[17]將100 μg pcDNA3-cC1 肌注免疫BALB/c小鼠，兩周后加強免疫1次，發(fā)現(xiàn)免疫鼠血清IgG和IgG2a顯著升高，脾淋巴細(xì)胞明顯增殖，脾淋巴細(xì)胞IL-2顯著升高，IL-4無顯著變化。同法免疫仔豬，攻擊后發(fā)現(xiàn)保護(hù)率為73.3%。吳丹等[18,19]用50 μg pCD-cC1重組質(zhì)粒肌注免疫昆明小鼠，兩周后加強免疫1次，發(fā)現(xiàn)免疫鼠血清IgG在第1次免疫后3～8周升高，在第1次免疫后8周達(dá)較高水平，IgG2a在第1次免疫后3～10周升高，在第1次免疫后4周達(dá)較高水平。同法免疫仔豬，攻擊后發(fā)現(xiàn)保護(hù)率為73.0%。用100 μg pCD-cC1肌注免疫BALB/c小鼠，間隔10 d加強免疫2次，然后用20 μg cC1-GST重組抗原加20 μg FCA皮下注射加強免疫1次，末次免疫后2周發(fā)現(xiàn)免疫鼠血清特異性IgG、IgG1和IgG2a顯著升高，脾淋巴細(xì)胞明顯增殖，并可分泌高水平IFN-γ和IL-4。Guo等[20]用200 μg cC1-GST重組抗原加0.2 mL FCA皮下注射免疫仔豬，免疫后6周進(jìn)行攻擊，攻擊后8周發(fā)現(xiàn)保護(hù)率為85.0%。用cC1-GST加FCA皮下注射免疫仔豬，間隔2周同法加強免疫2次，末次免疫后6、12周或20周進(jìn)行攻擊，攻擊后8周發(fā)現(xiàn)保護(hù)率分別為93.0%、84.0%、61.0%。用pCD-cC1免疫仔豬，間隔2周后用cC1-GST加強免疫2次，末次免疫后6、12周或20周進(jìn)行攻擊，攻擊后8周發(fā)現(xiàn)保護(hù)率分別為85.0%、77.0%、72.0%。

Cai等[21]用豬囊尾蚴AgB構(gòu)建DNA疫苗，分別用DNA苗和增強性DNA苗(DNA疫苗+豬轉(zhuǎn)移因子)免疫豬，在感染后第14 d或4個月以18 000枚蟲卵攻擊，3個月后剖檢所有實驗豬。結(jié)果表明，DNA疫苗組免疫后第14 d的減蟲率達(dá)91.2%，免疫后第4個月的減蟲率達(dá)99.5%；增強DNA疫苗組免疫后第14 d的減蟲率達(dá)93.1%，免疫后第4個月的減蟲率達(dá)84.9%。王慶敏等[22-23]將100 μg pcDNA3-AgB肌注免疫昆明小鼠和C57BL/c小鼠，1周后昆明小鼠加強免疫1次，C57BL/c小鼠間隔1周加強免疫2次，發(fā)現(xiàn)免疫鼠血清IgG和 IgG2a顯著升高，脾淋巴細(xì)胞明顯增殖，脾淋巴細(xì)胞IL-2顯著升高，IL-4無顯著變化。將1 000 μg pcDNA3-AgB肌注免疫仔豬，2周后間隔1周加強免疫2次，末次免疫后1周進(jìn)行攻擊，攻擊后保護(hù)率為80%。用pcDNA3-AgB和人細(xì)胞因子的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-IL-2聯(lián)合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)免疫鼠血清IgG和IgG2a明顯增高，脾淋巴細(xì)胞明顯增殖，可分泌高水平的IL-2，誘導(dǎo)仔豬保護(hù)率為83.4%，而pcDNA3-AgB組保護(hù)率為70%。Guo等[24]分別用200 μg和1 000 μg pcDNA3-AgB肌注免疫仔豬，免疫后9 d進(jìn)行攻擊，發(fā)現(xiàn)1 000 μg組于攻擊感染第14 d檢測到特異性抗體，并于第21 d達(dá)到較高水平，外周血單個核淋巴細(xì)胞(PBMC)明顯增殖，保護(hù)率為92.6%；而200 μg組保護(hù)率為36.6%。

3 Ts成蟲重組抗原

黃江等[25-36]應(yīng)用生物信息方法成功構(gòu)建了豬帶絳蟲成蟲全長cDNA表達(dá)文庫, 從豬帶絳蟲成蟲全長cDNA文庫中篩選出烯醇酶(ENO)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、延伸因子1(EF-1)、凝溶膠蛋白、蘋果酸脫氫酶(MDH)、細(xì)胞分裂周期蛋白37(CDC37)、腺苷酸激酶(ADK)等基因，從豬帶絳蟲基因組及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究入手, 對這些基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，并對其克隆、表達(dá)、重組蛋白的純化、抗血清的制備及免疫學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，就其酶活性、藥物作用和動物保護(hù)性實驗方面有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 語

豬帶絳蟲病和囊蟲病仍是世界范圍內(nèi)不可忽視的公共衛(wèi)生問題,我國也是該病高發(fā)的國家之一[37-38]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們通過構(gòu)建豬帶絳蟲不同發(fā)育階段的cDNA文庫，篩選出具有應(yīng)用價值的免疫診斷抗原或疫苗候選分子,研究其結(jié)構(gòu)、功能以及免疫學(xué)特性；在此基礎(chǔ)上，開展了診斷抗原敏感性和特異性的研究，以及不同類型基因工程疫苗的研制，這對豬帶絳蟲病和囊蟲病的診斷和防治具有十分重要的意義。但部分重組抗原診斷的敏感性和特異性尚不夠理想，與牛帶絳蟲、亞洲牛帶絳蟲存在交叉反應(yīng)，是否同時具有疫苗潛力還有待進(jìn)一步研究，能達(dá)到完全保護(hù)的基因工程疫苗也有待進(jìn)一步研究。

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