抗菌肽HBD基因工程表達的研究近況

萬 健，吳三橋，趙冠杰，陳 琛

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs) 是生物體特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，具有抵抗外界微生物侵害的作用，是生物天然免疫系統(tǒng)中的一個重要組成部分，與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定好、水溶性好、強堿性、廣譜抗菌和作用機制獨特等特點[1-4]。20世紀80年代瑞典科學(xué)家HG.Boman等從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導(dǎo)分離出第一個抗菌肽—天蠶素(cecropin)[5]。此后，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發(fā)現(xiàn)了2000多種抗菌肽。抗菌肽可以根據(jù)以上來源分類，也可以根據(jù)結(jié)構(gòu)將其分為5種：(1)α-螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽，如Cecropin A、Magainin；(2)β-折疊肽，如Tachyplesins；(3)富含半胱氨酸的抗菌肽，如HNP-1，-2和-3；(4) 富含特殊氨基酸的抗菌肽，該類型抗菌肽通常帶有一個或多個占主導(dǎo)地位的氨基酸， 如從牛的嗜中性細胞里分離出來的Indolicidin 由13個氨基酸殘基組成， 其中就含有5個色氨酸；(5)含稀有被修飾氨基酸的抗菌肽。人抗菌肽分為三類：防御素(defensins)、cathelicidins和富組蛋白(histatins)。

防御素是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一類具有抵抗外界微生物侵襲的堿性陽離子抗菌肽。人防御素根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)及所含3對二硫鍵連接方式的不同可分為α-防御素(human α-defensin, or human defensin neutrophil peptide,HNP )和β-防御素。α-防御素的3對二硫鍵以1-6，2-4，3-5的方式連接，β-防御素的3對二硫鍵以1-5，2-4，3-6的方式連接(如表1)，它們具有相似的3條反向平行β-片層結(jié)構(gòu)。Bensch等[6]于1995年首次從腎功能衰竭病人的血液透析液中分離出HBD-1并獲得其氨基酸序列，隨后其他5個 HBD被相繼發(fā)現(xiàn)，目前人β-防御素家族有6個主要成員，HBD-1～6。β-防御素主要表達于哺乳動物皮膚和粘膜上皮細胞，是機體抵御外界微生物侵害和參與免疫應(yīng)答的重要成員，具有極強的抗菌[7]、抗病毒[8-9]、抗腫瘤活性[10]以及免疫學(xué)活性[11-13]。本文對HBD的結(jié)構(gòu)、表達部位，原核、真核表達的系統(tǒng)，表達技術(shù)和方法進行了綜述，以期對人β-防御素及其他抗菌肽的基因工程重組表達提供思路。

1 HBD的結(jié)構(gòu)及表達部位

HBD基因定位于人染色體8p22～p23.1區(qū)小于1M的范圍內(nèi)，由2個外顯子和1個內(nèi)含子構(gòu)成，HBD家族的六個主要成員均位于該區(qū)域內(nèi)。HBD前體由93～95個氨基酸組成，包括信號肽、原片段和成熟肽3部分。在整個氨基酸序列中有2種高度保留的氨基酸，一種是位于N端的甘氨酸(2個)，另一種是半胱氨酸(6個)，保守的6個半胱氨酸殘基配對形成3對二硫鍵，起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用。二硫鍵和β-片層結(jié)構(gòu)可以使小分子防御素緊密連結(jié)以抵抗蛋白酶水解，即使在富含蛋白的吞噬溶酶體環(huán)境中仍能保持其活性，這也是防御素不同于其他抗微生物肽的主要原因。

HBD-1由36個氨基酸組成，約7.0 kb，其第一個外顯子編碼信號肽和原片段，第二個外顯子編碼成熟肽，在上皮細胞中是生理性表達。HBD-2由41個氨基酸組成，其中第一個外顯子編碼5′端非翻譯區(qū)信號肽區(qū)和前導(dǎo)肽區(qū)，第二個外顯子編碼部分前導(dǎo)肽成熟肽和3′端非翻譯區(qū)，HBD-2的各種生物活性都是由成熟肽來執(zhí)行完成。HBD-2主要表達在受感染刺激后的皮膚和黏膜組織中，是一種誘導(dǎo)型防御素，在感染、炎癥等狀態(tài)下表達明顯增強[14]，且研究人員發(fā)現(xiàn)NF-kB與這種誘導(dǎo)表達密切相關(guān)[15-16]。HBD-3主要表達于皮膚、口腔粘膜和扁桃體中，在呼吸道、生殖道上皮細胞和胎盤中亦有表達，可被TNF-a、IL-1β-、TGF、γ-干擾素等誘導(dǎo)表達。與HBD-1表達方式不同，HBD-2和HBD-3主要為誘導(dǎo)型表達。HBD-4在睪丸中高表達，在胃竇中也有較高表達，而在甲狀腺、肺、腎、子官和中性粒細胞中微表達。HBD-5和HBD-6僅在附睪細胞中有所表達。

表1 人β-防御素氨基酸序列、分子結(jié)構(gòu)

2 HBD的基因工程重組及表達

由于抗生素的長期廣泛使用，使得許多細菌都產(chǎn)生了耐藥性，比較突出的有2010年新德里“超級細菌”事件[17]。與傳統(tǒng)抗菌藥物相比，人β-防御素?zé)岱€(wěn)定性好，高效廣譜抗菌，具有極強的抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫學(xué)活性[18]，病原菌對其不易產(chǎn)生耐藥性。HBD的這些優(yōu)點決定其在醫(yī)藥衛(wèi)生、畜牧業(yè)、食品工業(yè)等方面將發(fā)揮極為重要的作用。怎樣大量獲得HBD就成了首要問題，目前獲取的主要途徑有3條：從細胞或體液中提取、化學(xué)合成、基因工程表達。HBD在組織中的表達量極少，純化工藝的難度與成本也較高，化學(xué)合成價格昂貴，且體內(nèi)蛋白質(zhì)往往需要翻譯后的修飾才具有活性。因此，通過基因工程手段大量生產(chǎn)HBD成為一條非常有效的途徑。

2.1HBD的原核表達 在各種表達系統(tǒng)中，原核表達系統(tǒng)是最早采用的，也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)。大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡單、生長繁殖快、安全性好、可高表達外源基因等優(yōu)點，是目前HBD表達采用最多的表達系統(tǒng)。

由于人β-防御素是一類陽離子小分子多肽，表達過程中極易在蛋白酶的作用下降解，而且對宿主細胞有細胞毒性作用，易造成宿主細胞的死亡。通常HBD基因在大腸桿菌中采用融合型表達，即目的蛋白HBD與一段融合標簽序列如組氨酸標簽蛋白(His-Tag)、硫氧化還原蛋白 (Thioredoxin, Trx)、類彈性蛋白(Elastin-like peptide, ELP)、小分子泛素樣修飾蛋白(Small ubiquitin-related modifier, SUMO)等融合表達，這些融合標簽可增加HBD mRNA的穩(wěn)定性，為進一步的蛋白分離、純化、檢測等提供便利，同時也可以有效的抑制宿主蛋白酶的降解活性，其作用類似于天然抗菌肽產(chǎn)生過程中能夠保護抗菌肽及宿主菌的前導(dǎo)肽部分[19]。HBD在大腸桿菌中的表達，國內(nèi)外開展了大量的研究，具體見表2。

表2 人β-防御素在大腸桿菌中的表達

注：DHFR=運載蛋白 Intein=內(nèi)含肽 ND= Not Determined

自Harder等[20]在原核細胞中采用了融合表達的方式，首次實現(xiàn)了HBD-3的體外表達以來，隨著對基因表達調(diào)控機制的深入研究，及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，原核表達系統(tǒng)在功能上得到了進一步的改善，HBD的原核表達經(jīng)歷了一個從無到有，表達量由低到高，抗菌活性由弱到強，純化過程由復(fù)雜到簡便的歷程。

雖然HBD在大腸桿菌中表達有諸多優(yōu)點，但大腸桿菌表達體系與其他體系相比也有一些缺點：高效表達但易形成包涵體，不能進行翻譯后的加工修飾，如糖基化、磷酸化、?；约岸蜴I的形成等，而且E.coli表達的蛋白還會保留它們氨基末端的甲硫氨酸，這會影響到目的蛋白的穩(wěn)定性，并產(chǎn)生免疫原性。最近有研究發(fā)現(xiàn)共表達折疊酶或者分子伴侶在一定程度上能克服包涵體的形成，分子伴侶本身不是功能蛋白的組成部分，但是能夠阻止分子間和分子內(nèi)不正確的折疊，進而幫助蛋白質(zhì)折疊成正確的構(gòu)象。Li等[25]利用小分子泛素蛋白(SUMO)融合表達系統(tǒng)，在大腸桿菌中表達HBD4-SUMO融合蛋白，可以促進HBD4的正確折疊，增加表達量，而且融合蛋白經(jīng)過SUMO酶酶切去除SUMO標簽后，N端沒有殘留氨基酸，得到純度較高的目的蛋白。

最近幾年，研究人員重點研究將目的蛋白與一些具有活性的小蛋白融合，進而促進目的蛋白在E.coil中的表達[27]，或者通過改造現(xiàn)有的表達載體，構(gòu)建各種促溶標簽載體，進而使在E.coli中以包涵體形式表達的蛋白以可溶性形式表達[28]。

2.2HBD的真核表達 真核表達系統(tǒng)包括酵母表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)等。酵母是一類低等真核生物，它既有類似原核生物的生長特性，又有一般真核生物基因表達調(diào)控機制及對表達產(chǎn)物的加工修飾和分泌能力，并且不會產(chǎn)生內(nèi)毒素，是目前HBD表達應(yīng)用最為普遍的真核表達系統(tǒng)之一。

2.2.1在酵母中表達 酵母表達系統(tǒng)中以畢赤酵母表達系統(tǒng)最為人熟知，具有操作簡單、高水平分泌表達外源蛋白、便于純化、利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。畢赤酵母可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長，而且甲醇能夠誘導(dǎo)畢赤酵母合成大量的乙醇氧化酶(AOX1)。AOX1是強啟動子，能夠高水平誘導(dǎo)表達外源基因。酵母帶有α分泌信號，可引導(dǎo)外源蛋白的分泌，減輕宿主細胞的代謝負荷以及宿主細胞蛋白水解酶的降解作用。近年來研究者開展了HBD在酵母中的表達，具體見表3。

表3 人β-防御素在酵母中的表達

雖然HBD在畢赤酵母中表達相對于在大腸桿菌表達起步比較晚，但畢赤酵母表達系統(tǒng)具有其他表達系統(tǒng)所無法比擬的優(yōu)點: 如對營養(yǎng)要求低，易于高密度發(fā)酵，自身分泌的背景蛋白少，因酵母是真核生物，安全性高，提供翻譯后加工和分泌的環(huán)境，不會形成包涵體，易于進行分離提純等，使得人β-防御素在畢赤酵母中表達的研究有很大的優(yōu)勢。

盡管如此，HBD在畢赤酵母中表達也存在著一些問題，比如畢赤酵母的糖基化程度比哺乳動物偏大，而且糖基化途徑與人不同，從而影響了HBD蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。過去的20多年里，有很多研究人員致力于畢赤酵母的N-糖基化改造過程中。王越等[34]成功構(gòu)建了敲除α-1, 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的巴斯德畢赤酵母，和野生型相比，大大降低了蛋白質(zhì)的糖基化程度，從而為酵母的糖基化工程提供了基礎(chǔ)。另外，信號肽加工不完全以及內(nèi)部降解等造成表達產(chǎn)物不均一，這在一定程度上限制了畢赤酵母的應(yīng)用。酵母表面展示技術(shù)，利用酵母細胞壁蛋白(α-凝集素)與外源蛋白相融合，融合蛋白表達分泌中由于其糖基化蛋白與細胞壁的共價結(jié)合作用，將外源蛋白錨定在細胞壁上[35]。提示，也許以后HBD的表達也能應(yīng)用這項技術(shù)，這樣可以減少純化工藝，提高回收率。

2.2.2在哺乳動物細胞中表達 HBD在哺乳動物細胞中表達也有報道，彭巍等[36]將HBD-3 cDNA插入到真核表達載體pEGFP-C1 中，構(gòu)建乳腺特異性表達載體pEBCD，脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染奶牛胎兒成纖維細胞G418，之后檢測到重組HBD-3蛋白可以在奶牛乳腺上皮細胞組織特異性表達。王慧等[37]構(gòu)建HBD-2真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1-zeo(+)-HBD-2，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細胞，RT-PCR檢測到HBD-2基因成功轉(zhuǎn)染293細胞，表達的HBD-2有較強的抗金黃色葡萄球菌活性。曹玉紅等分別將重組真核表達載體pcDNA3.1+/HBD4和pEGFP-N2/HBD4導(dǎo)入COS-7和HEK293細胞，均檢測到了HBD4蛋白的表達，并具有較強的殺菌作用[38-39]。

與其它真核細胞表達系統(tǒng)相比，HBD目的基因在哺乳動物細胞中表達與天然的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎完全相同，并且在蛋白合成起始信號、加工、分泌等方面具有獨特優(yōu)勢。但是哺乳動物表達系統(tǒng)成本相對較高，技術(shù)復(fù)雜，表達過程中存在著潛在的動物病毒的污染[40]。

3 展 望

人β-防御素因具有廣譜的抗菌活性，在抵御病原微生物的侵襲、參與免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，且病原菌對其不易產(chǎn)生耐藥性，因此它們有望成為一類新型的抗菌藥物，從而解決細菌的耐藥性和抗菌素的毒副作用等問題。通過基因工程技術(shù)制備HBD的研究，將會為今后制備類似藥物奠定基礎(chǔ)，指導(dǎo)抗微生物肽類藥物設(shè)計和開發(fā)，為其提供理想的分子設(shè)計骨架和模板。新型、高效、低毒、廣譜的HBD將會在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加劑、動植物抗病轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域發(fā)揮出重要的作用，對人類的健康和生活產(chǎn)生深遠的影響。

表4 各種表達系統(tǒng)比較

表4對HBD基因工程重組表達系統(tǒng)進行了比較，HBD在大腸桿菌中雖能高效表達但易形成包涵體，且后期分離純化過程比較繁瑣，表達后還需要活化才有生物活性；哺乳動物表達系統(tǒng)成本相對較高，技術(shù)復(fù)雜，表達過程中存在著潛在的動物病毒的污染；畢赤酵母表達系統(tǒng)因操作簡單、高水平分泌表達外源蛋白、便于純化、利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，表達產(chǎn)物HBD有較好的抑菌活性等優(yōu)點。隨著對基因表達調(diào)控機制的深入研究及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，所有的表達系統(tǒng)都可以在功能上有進一步的改善。但是，一些表達系統(tǒng)本身固有的缺陷也不能忽略，因此在選擇HBD表達系統(tǒng)時應(yīng)綜合考慮表達水平、表達周期、安全性、蛋白質(zhì)性質(zhì)等因素。

參考文獻：

[1]Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms[J]. Nature, 2002, 415(6870):389-395. DOI: 10.1038/415389a

[2]Chen C, Wang XH, Bo XW. Antibacterial peptides of the ovine reproductive tract[J]. Pro Biochem Biophys, 2009, 36(11): 1483-1489. DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00011 (in Chinese)

陳琛， 王新華， 薄新文. 綿羊生殖道抗菌肽[J]. 生物化學(xué)與生物物理進展， 2009， 36(11): 1483-1489. DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00011

[3]Chen C, Wu SQ, Li XS, et al. Structure, function and molecular design strategies of antibacterial peptide SMAP-29: a review[J]. Chin J Biotech, 2011, 27(6): 846-859. (in Chinese)

陳琛，吳三橋，李新生，等. 抗菌肽SMAP-29結(jié)構(gòu)功能及分子設(shè)計策略[J]. 生物工程學(xué)報，2011，27(6): 846-859.

[4]Silva NC, Sarmento B, Pintado M. The importance of antimicrobial peptides and their potential for therapeutic use in ophthalmology[J]. Int J Antimicrob Agents, 2013, 41(1): 5-10. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2012.07.020

[5]Steiner H, Hultmark D, Engstrom A, et al. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J]. Nature, 1981, 292(5820): 246-248. DOI: 10.1038/292246a0

[6]Bensch KW, Raida M, Magert HJ, et al. HBD-1: a novel beta-defensin from human plasma[J]. FEBS Letters, 1995, 368(2): 331-335. DOI: 10.1016/0014-5793(95)00687-5

[7]Hu QJ, Zuo P, Shao B, et al. Administration of nonviral gene vector encoding rat beta-defensin-2 ameliorates chronicpseudomonasaeruginosalung infection in rats[J]. J Gene Med, 2010, 12(3): 276-286. DOI: 10.1002/jgm.1435

[8]Alfredo GD, Mark KL, Jennifer B, et al. Human beta-defensins induce APOBEC3G expression by interacting with chemokine receptors, protecting highly susceptible cells from HIV infection[J]. Retrovirology, 2012, 9(suppl 1): 8. DOI: 10.1186/1742-4690-9-S1-P8

[9]Corleis B, Gostic WG, Johnson JA, et al. Human intestinal beta defensins inhibit viral replication and are diminished in chronic untreated HIV infection[J]. Retrovirology, 2012, 9(suppl 2): 202. DOI: 10.1186/1742-4690-9-S2-P202

[10]Bullard RS, Gibson W, Bose S K, et al. Functional analysis of the host defense peptide human beta defensin-1: new insight into its potential role in cancer[J]. Mol Immunol, 2008, 45(3): 839-848. DOI: 10.1016/j.molimm.2006.11.026

[11]Francesca M, Sabrina P, Luisa C, et al. Effects on antigen-presenting cells of short-term interaction with the human host defence peptide β-defensin 2[J]. Biochem J, 2011, 436(3): 537-546. DOI: 10.1042/BJ20101977

[12]Fiona S, Sheila W, Li HN, et al. Human β-defensin 3 has immunosuppressive activityinvitroandinvivo[J]. Eur J Immunol, 2010, 40(4): 1073-1078. DOI: 10.1002/eji.200940041

[13]Laura KF, Yvonne KM, Alicia RM, et al. Human beta-defensin 3 induces maturation of human langerhans cell-like dendritic cells: an antimicrobial peptide that functions as an endogenous adjuvant[J]. J Invest Dermatol, 2013, 133(2): 460-468. DOI: 10.1038/jid.2012.319

[14]Hollox EJ. Beta-defensins and crohn's disease: confusion from counting copies[J]. Am J Gastroenterol, 2010, 105(2): 360-362. DOI: 10.1038/ajg.2009.573

[15]Paris S, Wolgin M, Kielbassa AM, et al. Gene expression of human beta-defensins in healthy and inflamed human dental pulps[J]. J Endod, 2009, 35(4): 520-523. DOI: 10.1016/j.joen.2008.12.015

[16]Yoon YM, Lee JY, Yoo D, et al. Bacteroides fragilis enterotoxin induces human beta-defensin-2 expression in intestinal epithelial cells via a mitogen-activated protein kinase/IkB kinase/NF-kB-dependent pathway[J]. Infect Immun, 2010, 78(5): 2024-2033. DOI: 10.1128/IAI.00118-10

[17]Yong D, Toleman MA, Giske CG, et al. Characterization of a new metallo-β-lactamase gene,b1aNDM-1, and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure inKlebsiellapneumoniaesequence type 14 from India[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53 (12): 5046-5054. DOI: 10.1128/AAC.00774-09

[18]Prado-Montes de Oca E. Human β-defensin 1: A restless warrior against allergies, infections and cancer[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(6): 800-804. DOI: 10.1016/j.biocel.2010.01.021

[19]Vassilevski AA, Kozlov SA, Grishin EV. Antimicrobial peptide precursor structures suggest effective production strategies[J]. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov, 2008, 2(1): 58-63. DOI: 10.2174/187221308783399261

[20]Harder J, Bartels J, Christophers E, et al. Isolation and characterization of human beta-defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic[J]. J Bio Chem, 2001, 276(8): 5707-5713. DOI: 10.1074/jbc.M008557200

[21]Chen S, He FT, Dong YL, et al. The cloning, high level expression inEscherichiacoliof human beta-defensin 3 and its antimicrobial activity analysis[J]. Chin J Biotechnol, 2004, 20(4): 490-495. DOI: 10.3321/j.issn:1000-3061.2004.04.004 (in Chinese)

陳姍，何鳳田，董燕麟，等. 人β-防御素3融合蛋白在大腸桿菌中的表達、純化與活性分析[J]. 生物工程學(xué)報，2004，20(4): 490-495.DOI: 10.3321/j.issn:1000-3061.2004.04.004

[22]Xu ZN, Peng L, Zhong ZX, et al. High-level expression of a soluble functional antimicrobial peptide, human β-defensin 2 inEscherichiacoli[J]. Biotechnol Prog, 2006, 22(2): 382-386. DOI: 10.1021/bp0502680

[23]Huang L, Ching CB, Jiang RR, et al. Production of bioactive human beta-defensin 5 and 6 inEscherichiacoliby soluble fusion expression[J]. Protein Expr Purif, 2008, 61(2): 168-174. DOI: 10.1016/j.pep.2008.05.016

[24]Shen Y, Ai HX, Song R, et al. Expression and purification of moricin CM4 and human beta-defensins 4 inEscherichiacoliusing a new technology[J]. Microbiol Res, 2010, 165(8): 713-718. DOI: 10.1016/j.micres.2010.01.002

[25]Li JF, Zhang J, Zhang Z, et al. Production of bioactive human beta-defensin-4 inEscherichiacoliusing SUMO fusion partner[J]. Protein J, 2010, 29(5): 314-319. DOI: 10.1007/s10930-010-9254-4

[26]Dong J, Yu HG, Zhang YL, et al. Soluble fusion expression and characterization of human beta-defensin 3 using a novel approach[J]. Protein Pept Lett, 2011, 18(11): 1126-1132. DOI: 10.2174/092986611797201020

[27]Leviatan S, Sawada K, Moriyama Y, et al．Combinatorial method for overexpression of membrane proteins inEscherichiacoli[J]. J Biol Chem, 2010, 285(31): 23548-23556. DOI: 10.1074/jbc.M110.125492

[28]Hu J, Qin HJ, Gao FP, et al．A systematic assessment of mature MBP in membrane protein production: overexpression, membrane targeting and purification[J]．Protein Expr Purif, 2011, 80(1): 34-40. DOI: 10.1016/j.pep.2011.06.001

[29]Cipáková I, Hostinová E. Production of the human-beta-defensin usingsaccharomycescerevisiaeas a host[J]. Protein Pept Lett, 2005, 12(6): 551-554. DOI: 10.2174/0929866054395761

[30]ZhaoYH, Huang PL, Xu LX, et al. Expression of human β defensin 3 inpichiapastoris[J]. J Qufu Nor Uni:Nat Sci, 2006, 32(2): 107-111. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5337.2006.02.027 (in Chinese)

趙亞華，黃蓬亮，徐來祥，等.人β-防御素3基因在巴斯德畢赤酵母細胞中的表達[J]. 曲阜師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2006，32(2):107-111. DOI : 10.3969/j.issn.1001-5337.2006.02.027

[31]Tuo XY. Expression and purification of hBD3-BPI fusion protein inpastorispichayeast system and its bioactivity analysis[D]. Beijing: Chinese PLA Postgraduate Medical School, 2007. (in Chinese)

庹曉曄.hBD3-BPI融合蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中的表達及其產(chǎn)物的純化和生物學(xué)活性研究[D]. 北京：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院，2007.

[32]Dai J. Study on the activity of human beta-defensin-3 expressing inPichiaPastoris[D]. Guangzhou: Sun Yat-sen University, 2010. (in Chinese)

代娟. 人β-防御素-3在畢赤酵母中的分泌表達及活性研究[D]. 廣州：中山大學(xué)，2010.

[33]Bao YY, Zhao QJ, Xu TT, et al. Optimization mosaic gene of human β defensin 3 and plant des-pGlu1-Brazzein and its expression inPichiapastoris[J]. J Henan Agri Uni, 2013, 47(1): 77-82. DOI: 10.3969/j.issn.1000-2340.2013.01.015 (in Chinese)

暴元元，趙青君，徐婷婷，等. 人β-防御素3與植物巴西甜蛋白基因密碼子的優(yōu)化及其在畢氏酵母中的表達[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，47(1)：77-82. DOI: 10.3969/j.issn.1000-2340.2013.01.015

[34]Wang Y, Gong X, Chang SH, et al. Apichiapastoriswith α-1, 6-mannosyltranferases deletion and its use in Expression of HSA/GM-CSF Chimera[J]. Chin J Biotechnol, 2007, 23(5): 907-914. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5337.2006.02.027 (in Chinese)

王越，鞏新，唱韶紅，等. α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除的畢赤酵母菌株構(gòu)建及其用于融合蛋白HSA/GM-CSF表達的研究[J]. 生物工程學(xué)報，2007，23(5)：907-914. DOI : 10.3969/j.issn.1001-5337.2006.02.027

[35]Han SY, Li HZ, Jin Z, et al. Yeast cell surface display and its application of enzymatic synthesis in non-aqueous phase[J]. Chin J Biotechnol, 2009, 25(12): 1784-1788. DOI: 10.3321/j.issn:1000-3061.2009.12.005 (in Chinese)

韓雙艷，李華珍，金子，等. 酵母細胞表面展示技術(shù)及其在非水相酶催化合成中的應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報，2009，25(12)：1784-1788. DOI: 10.3321/j.issn:1000-3061.2009.12.005

[36]Peng W, Lan ZG, Ma JJ, et al. Construction of HBD 3 gene mammary-specific expression vector and eukaryotic expression[J]. Chin J Biotechnol, 2009, 25(7): 968-974. DOI: 10.3321/j.issn:1000-3061.2009.07.002 (in Chinese)

彭巍，蘭志剛，馬晶晶，等. HBD-3基因的乳腺特異性表達載體的構(gòu)建及真核表達[J]. 生物工程學(xué)報，2009，25(7)：968-974. DOI: 10.3321/j.issn:1000-3061.2009.07.002

[37]Wang H, Dong PR, Zhou Y. Antimicrobial activities of the culture supernatant of 293 cells transfected with recombinant HBD-2 gene eukyriotic expressive plasmid [J]. J Biomed Eng, 2009, 2:371-373. DOI:10.3321/j.issn:1001-5515.2009.02.031 (in Chinese)

王慧，董碧蓉，周焱. 重組人源β-防御素-2基因真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞的表達產(chǎn)物抗菌活性的研究[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2009，26(2)：371-373. DOI:10.3321/j.issn:1001-5515.2009.02.031

[38]Cao YH, Cheng SQ, Zhang GY, et al. Eukaryotic expression of human β defensin 4 gene in cos-7 cells[J]. Med J West China, 2012, 24(9): 1668-1670.DOI: 10.3969/j.issn.1672-3511.2012.09.007 (in Chinese)

曹玉紅，張光運，成勝權(quán)，等. 人β-防御素4基因在COS-7細胞中的轉(zhuǎn)染表達[J]. 西部醫(yī)學(xué)，2012，24(9)：1668-1670. DOI: 10.3969/j.issn.1672-3511.2012.09.007

[39]Cao YH, Cheng SQ, Zhang GY, et al. Eukaryotic expression of human β defensin 4 gene in HEK293 cells[J]. J Med Postgra, 2012, 25(10): 1020-1023. DOI: 10.3969/j.issn.1008-8199.2012.10.004 (in Chinese)

曹玉紅，成勝權(quán)，張光運，等. 人β-防御素4基因在HEK293細胞中的轉(zhuǎn)染表達[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012，25(10)：1020-1023. DOI: 10.3969/j.issn.1008-8199.2012.10.004

[40]Fan CY, Feng LX, Fan JL, et al. Recent advances on the expression systems for recombinant protein production[J]. Biotechnology, 2012, 22(2): 76-80. DOI: 10.3969/j.issn.1004-311X.2012.02.049 (in Chinese)

范翠英，馮利興，樊金玲，等. 重組蛋白表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 生物技術(shù)，2012，22(2)：76-80. DOI: 10.3969/j.issn.1004-311X.2012.02.049