植物組培脫毒技術(shù)及其在藥用植物藏紅花中的應(yīng)用

李軍 高廣春 李白 朱志明

（1. 嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，嘉興 314016；2. 嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，嘉興 314001；3. 嘉興市天禾藏紅花專業(yè)合作社，嘉興 314000）

植物病毒廣泛存在于果樹、蔬菜、花卉等植物中，病毒通過植物的無性繁殖在植物體內(nèi)傳遞及積累，最終造成植物生長受到抑制、產(chǎn)量及品質(zhì)下降。病毒感染是無性繁殖植物種質(zhì)退化、產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要原因。自從1952年Morel［1]利用感染花葉病毒的大麗菊莖尖分生組織培養(yǎng)得到無病毒植株以來，植物組培脫毒技術(shù)便在生產(chǎn)實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用。植物組培脫毒技術(shù)是利用病毒在植物體內(nèi)分布的不均勻性（在植物莖尖等分裂旺盛、生長迅速的組織細(xì)胞內(nèi)含量很低）及植物細(xì)胞的全能性，采用不含病毒的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，利用植物細(xì)胞的全能性最終分化獲得無病毒植株。通過植物組培脫毒方法，可以脫除患病毒病植株的病毒，起到植株復(fù)壯，提高產(chǎn)量及質(zhì)量的作用。植物組培脫毒技術(shù)現(xiàn)已在馬鈴薯、甘薯、草莓、部分觀賞花卉及藥用植物的組培快繁中得到廣泛研究及應(yīng)用，對其規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化及區(qū)域化生產(chǎn)應(yīng)用起到推動作用。

藏紅花（Crocus sativusL.）是鳶尾科番紅花屬多年生草本植物，主要靠分球無性繁殖。長期無性繁殖容易積累病毒，使品質(zhì)及產(chǎn)量下降。藏紅花主要病毒有蕪菁花葉病毒（Turnip mosaicvirus，TuMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、鳶尾花葉病毒（Irismosaicvirus，IMV）、煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）和菜豆黃花葉病毒（ByMV）［2-4]，通過組織培養(yǎng)的方式培育無病毒球莖是提高藏紅花種球質(zhì)量和產(chǎn)量的有效途徑。

本文綜述了植物組織培養(yǎng)脫毒的技術(shù)方法及其近幾年的應(yīng)用情況，同時(shí)針對藥用植物藏紅花脫毒球莖培育中應(yīng)用的脫毒技術(shù)做了總結(jié)及探討。

1 植物組織培養(yǎng)常用脫毒技術(shù)

1.1 莖尖培養(yǎng)脫毒

莖尖培養(yǎng)脫毒是利用病毒在植物體內(nèi)的分布不均勻性，在分裂旺盛的莖尖尤其是生長點(diǎn)區(qū)域（0.1-1.0 mm）帶病毒最少或不帶病毒，越靠近尖端，病毒含量越低。因?yàn)椴《驹谥参矬w內(nèi)隨維管系統(tǒng)遷移，在莖尖分生組織中沒有維管束系統(tǒng)，病毒通過胞間連絲傳遞比較慢，而細(xì)胞分裂速度快，所以莖尖生長點(diǎn)部位幾乎沒有病毒［5]。莖尖脫毒和再生的關(guān)鍵是切取莖尖的大小，因?yàn)槊摱镜某晒β逝c莖尖大小成反比，而再生能力與莖尖大小成正比，因此切取合適大小的莖尖分生組織是莖尖培養(yǎng)脫毒成功的關(guān)鍵［6]。莖尖培養(yǎng)具有脫毒效果好、繁殖系數(shù)高、變異率低的優(yōu)點(diǎn)，但也受到取材大小的限制。

自從1952年Morel［1]闡明用莖尖分生組織可從大麗菊中消除病毒以來，莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)在植物組織培養(yǎng)脫毒中得到廣泛研究與應(yīng)用［7-12]，大量研究結(jié)果表明，0.2 mm左右的莖尖在脫毒率和成活率方面可以達(dá)到最優(yōu)。以0.2 mm莖尖為外植體，馬鈴薯的成活率和脫毒率分別為68%和56%［13]，葡萄的成活率和脫毒率為75%和12%［14]。

1.2 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

由于莖尖培養(yǎng)受取材大小的限制，近年來在植物組織培養(yǎng)中多采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的方法脫毒，這種方法對于一些難于用莖尖培養(yǎng)或熱處理脫毒的果樹病毒效果很好。采用這種方法，即使用大的外植體，也能增加獲得的無病毒植株數(shù)。熱處理脫毒主要是利用病毒受熱的不穩(wěn)定性而失去其活性達(dá)到脫病毒的目的。熱處理過程減慢病毒在植株體內(nèi)擴(kuò)散速度的同時(shí)加快植物的生長，針對不同植物、不同品種和不同植物病毒對溫度的敏感程度不同的特點(diǎn)，進(jìn)行一定溫度和時(shí)間范圍的熱處理，使植物的生長速度明顯超過病毒在植物體內(nèi)擴(kuò)散的速度，從而使一部分正在快速生長的植物組織，如頂芽、嫩稍的尖端不含病毒，把不含病毒的部分切下來接種到適宜的培養(yǎng)基上，最終培養(yǎng)出無毒植株［15]。

熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒的熱處理一般采用35-55℃的熱水或高溫蒸汽、高溫空氣處理，溫度越高處理的時(shí)間越短，處理時(shí)間根據(jù)溫度及外植體的不同從4 h-40 d不等，多采用熱處理結(jié)束后切取莖尖培養(yǎng)獲得無毒苗［16-19]。解曉紅等［16]用半夏無菌苗為外植體，38℃高溫40 d后切取莖尖培養(yǎng)，脫毒率達(dá)到88.9%。針對不同的材料選擇合適的熱處理溫度及時(shí)間，如40℃水浴熱處理草莓匍匐莖4 h［17]、36℃熱處理百合珠芽10 d［18]、38.5℃熱處理羅漢果組培苗10 d［19]，可獲得脫毒率為100%的無毒苗，

由于外植體成活率隨熱處理時(shí)間增加而降低，近幾年還發(fā)展出了變溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)來提高外植體成活率和脫毒率的方法。顧沛雯［20]研究了變溫處理對葡萄組培苗的脫毒效果，發(fā)現(xiàn)變溫（白天38℃，夜晚32℃）比恒溫（38℃）處理成活率提高15.6%，成活率達(dá)到50%，而脫毒率相差不大。同時(shí)與單純莖尖培養(yǎng)相比，熱處理后小株成活率和脫毒率平均增加7.5%和8.5%。石貴玉等［21]研究了毛葡萄的組培脫毒技術(shù)，發(fā)現(xiàn)變溫處理（白天 37℃處理8 h，晚上22℃處理16 h）10-15 d，莖尖存活率可達(dá)80%以上，脫毒率達(dá)100%。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)脫毒

愈傷組織誘導(dǎo)脫毒是通過植物器官或組織的培養(yǎng)來誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，從愈傷組織分化出芽并長成植株，經(jīng)病毒檢測篩選獲得無毒植株的方法。愈傷組織誘導(dǎo)脫毒的應(yīng)用中常結(jié)合莖尖培養(yǎng)及花藥培養(yǎng)等來提高脫毒效率。愈傷組織誘導(dǎo)脫毒技術(shù)現(xiàn)已在甘蔗、草莓和馬鈴薯等多種植物上獲得成功。

李松等［22]研究了甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)莖尖胚狀體分化苗增殖5代后擴(kuò)繁2 589倍，宿根矮化病（Ratoon stunting disease，RSD）病毒去除率95%、花葉病去除率100%。晁慧娟等［23]及肖君澤等［24]以花粉發(fā)育處于單核靠邊期的草莓花蕾為外植體進(jìn)行花藥脫毒培養(yǎng)，結(jié)果表明預(yù)冷處理72 h是最適合的花藥低溫處理時(shí)間，研究還篩選出最適合花藥愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的培養(yǎng)基。

1.4 病毒抑制劑處理脫毒

病毒抑制劑能夠不同程度地脫除植物病毒，其作用機(jī)理主要為競爭寄主細(xì)胞表面受體、阻礙病毒穿入脫殼、阻礙病毒生物合成和提高寄主抗病能力4種方式。采用病毒抑制劑與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒方法，對取材大小要求不嚴(yán)并且能脫除多種病毒，接種莖尖可大于1 mm，容易分化出苗，提高存活率［25]。對于有些比較難脫除的病毒，采用病毒抑制劑結(jié)合熱處理和莖尖培養(yǎng)的方法使用，效果較好。

目前常用于組織培養(yǎng)的病毒抑制劑有9-（2-羥二氧）甲基鳥嘌呤、2-硫尿嘧啶、疊氮胸苷、DHT和病毒唑等。在眾多病毒抑制劑中，病毒唑的抑制效果較好，也得到了廣泛應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)35 mg/L病毒唑?qū)Σ煌贩N的馬鈴薯病毒脫除效果都可以達(dá)到60%-80%，比沒有添加病毒唑的莖尖處理脫毒效果提高27%［28]；40 mg/L和60 mg/L病毒唑?qū)疃徊《荆≒lum pox virus，PPV）的脫毒率達(dá)到15.38%和16.66%［29]。針對不同的材料需要研究合適的脫毒效果最好的病毒抑制劑，李正民等［26]研究了不同病毒抑制劑對蝴蝶蘭建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）的脫除效果，研究表明安吉寡糖素的脫毒效果最好，對CyMV的脫除率為83.33%，對ORSV的脫除率為66.67%；顧沛雯［20]研究發(fā)現(xiàn)病毒鈍化劑（WCT和豐源寶）處理對葡萄病毒具有良好的抑制作用。

在病毒抑制劑與其他脫毒方法結(jié)合使用方面，張惠華等［27]發(fā)現(xiàn)對東方百合進(jìn)行熱處理（39℃處理15 d）后結(jié)合10 mg/L病毒唑來處理，百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）及百合斑駁病毒（Lily mottle virus，LMoV）脫毒率分別達(dá)到55%和40%。

1.5 超低溫處理脫毒

超低溫處理脫毒是近些年發(fā)展起來的一種新的脫毒方法，其原理是利用液氮超低溫（-196℃）對植物細(xì)胞的選擇性殺傷，得到存活的頂端分生組織。頂端分生組織能夠在超低溫處理后存活，與其自身的細(xì)胞特性有關(guān)。含有病毒的細(xì)胞的液泡較大，液泡中含有的水分多，在超低溫處理過程中易被形成的冰晶破壞致死，而增殖速度較快的頂端分生組織含水分少，胞質(zhì)濃，抗凍性強(qiáng)，不宜被凍死。液氮中的超低溫能殺死含有較大液泡的細(xì)胞，而保存液泡小的頂端分生組織細(xì)胞，頂端分生組織不含或只含有少量病毒，因此得到的植株很有可能是無毒的。

超低溫脫毒方法最早由Brison等［30]開創(chuàng)，他們用超低溫結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法，成功的去除了李屬根狀莖上的李痘病毒（Plum pox virus，PPV），脫毒率達(dá)到50%，是莖尖剝離脫毒率19%的2.5倍。Wang等［32，33]應(yīng)用該技術(shù)做了大量研究，將該技術(shù)應(yīng)用于馬鈴薯、甘薯、葡萄等植物，并獲得了無毒植株，同時(shí)還將超低溫處理、熱處理及莖尖培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來脫除了木莓叢矮病毒（Raspberry bushy dwarf virus，RBDV）脫毒率達(dá)到35%。Helliot等［31]利用超低溫脫毒方法，從香蕉中脫除黃瓜花葉病毒及香蕉條斑病毒（Banana streak virus，BSV），病毒脫毒率達(dá)到30%和90%。靳慧潔等［34]結(jié)合超低溫脫毒、莖尖培養(yǎng)及熱處理脫毒方法成功獲得了百合脫毒苗。超低溫處理脫毒基于超低溫保存，理論上，只要能利用超低溫保存種質(zhì)的植物都可以用超低溫處理進(jìn)行脫毒，其應(yīng)用前景非常廣闊［35，36]。

2 藏紅花脫毒種球培育方法

由于藏紅花葉基生，沒有一般意義的莖，其生長點(diǎn)位于葉叢基部與球莖結(jié)合處，剝?nèi)∑淝o尖難度極大，同時(shí)0.5 mm以下微莖尖成活率低，剝?nèi)‰y度大，而較大莖尖一般脫毒效果不佳［2]，現(xiàn)有藏紅花脫毒球莖培育研究多采用莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理、愈傷組織誘導(dǎo)及病毒抑制劑等方法才能獲得較高的成活率及脫毒率。

朱保華等［2]采用變溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)與化學(xué)處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)2種方法培育出了不含CMV、TuMV、TRV及IMV病毒的藏紅花植株。將帶芽點(diǎn)的球莖進(jìn)行變溫處理36℃（12 h）/18℃（12 h）后，剝?nèi)?.5-1.0 mm的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，莖尖成活率26.7%；將3-5 cm帶葉片的球莖滅菌后取0.5-1.0 mm的莖尖接種到添加5-10 mg/L濃度病毒唑的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，莖尖成活率25%-45%。陳書安等［3]用熱處理結(jié)合愈傷組織誘導(dǎo)方法獲得了無毒芽，以高溫處理（35℃）的分化芽為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)25 d后獲得愈傷組織，該愈傷組織再經(jīng)過高溫處理（35℃）可獲得高溫脫毒的藏紅花愈傷組織，再分化培養(yǎng)50 d后可獲得高溫脫毒的藏紅花分化芽。朱昱等［37]采用莖尖培養(yǎng)結(jié)合愈傷組織誘導(dǎo)方法也獲得了脫毒球莖。

3 結(jié)語

通過組織培養(yǎng)脫毒可以提高作物產(chǎn)量及質(zhì)量，組培脫毒技術(shù)也得到越來越多的研究與應(yīng)用，目前通過組培實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的脫毒試管苗在果樹、蔬菜、花卉及藥用植物上的研究已經(jīng)十分普遍，如馬鈴薯、甘薯、蘋果、葡萄、草莓、蝴蝶蘭、天山雪蓮和金線蓮等。植物組培脫毒技術(shù)的不斷改進(jìn)和提高以適應(yīng)大規(guī)模的工廠化和商品化勢在必行。脫毒技術(shù)的應(yīng)用也逐步從莖尖培養(yǎng)、熱處理脫毒、病毒抑制劑處理等單一脫毒方法向2種、3種方法結(jié)合使用發(fā)展，逐步提高脫毒率及成苗率。

目前藏紅花組織培養(yǎng)方面的研究多集中在通過球莖切塊來分化成芽或通過球莖切塊誘導(dǎo)愈傷組織并進(jìn)一步分化成芽的快繁研究［38-41]，對于脫毒球莖的研究報(bào)道很少。球莖切塊直接誘導(dǎo)分化成芽不能達(dá)到脫毒的目的，通過誘導(dǎo)愈傷組織分化成芽雖然增殖系數(shù)比球莖直接誘導(dǎo)成芽高，而且有可能獲得無毒植株，但是脫毒率低。由于藏紅花難于直接剝?nèi)?.5 mm以下莖尖來進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，同時(shí)球莖取材相對容易、組培快繁方面（球莖切塊誘導(dǎo)愈傷組織及直接分化成芽）的研究較多，為藏紅花培育脫毒球莖提供了新的研究思路，因此通過球莖切塊誘導(dǎo)愈傷組織結(jié)合熱處理或病毒抑制劑處理將是藏紅花無毒球莖培育的有效途徑。

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