基于雙向電泳－MALDI質譜分析的蛋白組學本科教學實驗

岑衛(wèi)健，朱平川

(廣西大學 亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004)

當前，基因組學已經從結構基因組學發(fā)展到功能基因組學，而蛋白質組學又是功能基因組學最尖端的領域［1］。蛋白質組學已成為研究生物學過程及直接描述細胞和組織變化的有力手段。特別在醫(yī)藥學領域，蛋白質組學是尋找人類疾病的新生物標志物和發(fā)現(xiàn)藥物治療新靶點的一種主要工具［2］。雙向電泳結合生物質譜技術是蛋白質組學研究中的最常用的蛋白質分離和鑒定技術之一［3］，是目前廣泛應用、經典的蛋白質組學研究途徑［4］。但這項實驗難度較大，對實驗員的實驗技能有較高的要求［5］，而且實驗藥品昂貴，影響實驗結果的因素很多。據(jù)了解，國內的院校在相關專業(yè)本科實驗教學中開設“雙向電泳－MALDI質譜分析”實驗的寥寥無幾。但考慮到現(xiàn)代生物科學發(fā)展的需要以及專業(yè)的特點，我們改變了傳統(tǒng)的教學模式，以“雙向電泳－MALDI質譜分析”實驗為試點，充分利用亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室的大型儀器，積極進行教學模式的改革。學校特批了一筆大型儀器共享平臺的開放資金用于生物技術專業(yè)的學生開展“雙向電泳－MALDI質譜分析”實驗，總學時為30個。

1 傳統(tǒng)的實驗模式存在的問題

廣西大學生命科學與技術學院在生物技術和生物工程兩個專業(yè)的本科生中開設有生化技術實驗課，其中有關蛋白組學方面的實驗內容包括考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白質溶液的凝膠層析脫鹽等。以SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測定實驗為例，實驗流程如下:SDS－聚丙烯酰胺凝膠、加蛋白樣品、電泳、染色、脫色。由于受實驗條件的限制，此實驗僅僅做到了一維的凝膠電泳，實驗內容單一，教學目標也僅僅是讓學生認識到蛋白電泳最基礎的步驟而已。學生無法做到理論聯(lián)系實踐，實驗過程處于被動狀態(tài)，做完實驗后也只是懂得課本上的理論而已。

2 基于雙向電泳－MALDI質譜分析的蛋白組學實驗

在傳統(tǒng)觀念中，大型儀器價值較大，維護及維修費用昂貴。如在本科教學中使用大型儀器出現(xiàn)損壞，則會影響科研工作的進展，所以大型儀器基本上只用于科研工作中。為了求證大型儀器應用于本科教學的可行性，我們嘗試在本科3年級生物技術專業(yè)的學生中開展基于雙向電泳－MALDI質譜分析的蛋白組學實驗。這部分學生已完成了《有機化學》《分析化學》《分子生物學》和《生物化學》等理論課和基礎實驗課，掌握了一定的理論知識和實驗技能，具備了一定的科研實力。為了更好激發(fā)學生的學習興趣，我們將實驗設計成三個階段。

2.1 理論知識鞏固階段

在實驗的前兩周，要求學生4～5名為1組，通過閱讀文獻，觀看雙向電泳－MALDI質譜分析實驗視頻，老師講解，通讀實驗手冊，以野油菜黃單胞菌為材料制定實驗方案。

2.2 雙向電泳階段

實驗設施依托亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室的大型儀器開放平臺。實驗室全天開放，學生不局限于某一時間段進行實驗。實驗基本流程如下:

第一向等電聚焦。在蛋白上樣液中加入5(v/v)IPG緩沖液。每根24 cm PH3－10 IPG膠條蛋白上樣量為350 μg。等電聚焦條件:20℃;30 V，6 h;60 V，6 h;500 V，1 h;1 000 V，1 h;1 h Gradient 1 000～8 000 V;8 000 V，80 000 vhr。

平衡。等電聚焦后的膠條在15 mL平衡液Ⅰ［0.05 mol/L Tris－cL pH8.8，6 mol/L尿素，30(v/v)甘油，10 g/L DTT，2 (w/v)SDS，0.002(w/v)溴酚藍］中平衡15 min，再在15 mL平衡液Ⅱ(將10 g/L DTT換成40 g/L碘已酰胺，其余組分均同平衡液Ⅰ)中平衡15 min。

第二向SDS－PAGE。將平衡好的IPG膠條轉移到SDS－PAGE凝膠上，用封閉液(0.192 mol/L甘氨酸，0.025 mol/L Tris Base，0.1 (w/v)SDS，0.5 低熔點瓊脂糖)封頂，連接Ettan DALT twelve系統(tǒng)，進行第二向SDS－PAGE。凝膠先用10 mA/塊凝膠恒流進樣，再改為30 mA/塊凝膠恒流直到溴酚藍前沿到達凝膠底部。

硝酸銀染色具體步驟如下:固定(200 mL甲醇，50 mL冰乙酸，250 mL超純水)30 min;敏化(150 mL甲醇，34 g無水乙酸鈉，1.0 g硫代硫酸鈉，加超純水至500 mL)30 min;漂洗 3次，5 min/次;銀染(1.25 g硝酸銀加超純水至500 mL)20 min;漂洗 20 min，1 min/次;顯色(200 μL甲醛，12.5 g碳酸鈉，加超純水至500 mL)4～10 min;終止(12 冰乙酸)2 min。

凝膠圖像分析。GE公司的Image Scanner掃描儀對凝膠掃描，用ImageMaster2－DE Platinum 5.0軟件對圖像進行后續(xù)分析。

2.3 質譜分析階段

雙向電泳實驗完成后，每組學生隨機從凝膠上5～10個蛋白點做質譜分析。在質譜上樣前，要先將蛋白質酶解成肽段，然后點靶，質譜進樣鑒定蛋白。酶解是質譜分析是否成功的關鍵因素，所有的試劑藥現(xiàn)配現(xiàn)用，具體步驟如下:

1)脫色。每管加入現(xiàn)配脫色液50～80 μL(視膠粒大小而定)，靜置2 min;當膠粒由棕黑色變成亮黃色(與脫色液顏色相同)，迅速加入400 μL Milli－Q水終止反應;吸出液體后重新加入400 μL Milli－Q水振蕩洗滌，再吸出液體。

2)洗滌。每管加入 200μL 40mmol/L NH4HCO3，振蕩洗滌2 min，吸出液體，重復一次。

3)脫水。每管加入100～150 μL ACN，振蕩脫水;待膠粒變白，吸出ACN，于真空干燥箱或真空濃縮儀干燥10 min。

4)酶解。根據(jù)膠粒大小，加入合適體積的胰蛋白酶工作液(以完全覆蓋膠粒為準)，冰浴45 min，使膠粒充分吸收酶液并溶脹。然后，吸出多余酶液，加入20～40 μL覆蓋液(以完全覆蓋膠粒為準)，倒置放于37℃烘箱中孵育過夜(12～16 h)。

5)肽段萃取。將酶解過夜的EP管取出，吸出酶解溶液于另一干凈1.5 mL EP管內，在裝膠粒的EP管中加入萃取液20 μL，振蕩洗滌20 min，吸取液體與第一次吸取的液體合并，再往膠粒中加入萃取液20 μL，振蕩洗滌10 min，并超聲5 min，吸取液體與前兩次的合并。

6)真空干燥。將離心的肽段萃取液于真空干燥機內濃縮抽干，加入1 μL 0.1 TFA水溶液復溶，置于－20℃環(huán)境中保存待用。

2.4 實驗總結

雙向電泳－MALDI質譜分析實驗是一個綜合性實驗，涉及的實驗內容比較多，實驗步驟繁瑣，對實驗人員的實驗操作技巧要求比較高。本次實驗共有6組學生，總人數(shù)為30名。其中有1組學生得到了非常好的雙向電泳圖譜;3組學生通過質譜的鑒定均鑒定得到6～10個蛋白;1組學生實驗失敗。每組學生實驗結束后均要寫一篇實驗總結報告，總結實驗失敗的原因，下次應該如何改進。通過這個實驗，學生對蛋白質組學有了全面的了解，可以將課本上的理論知識與實驗聯(lián)系，這是新時代生物技術專業(yè)畢業(yè)生應具備的素質。

3 開放大型儀器培養(yǎng)技術型人才

本次實驗探索在老師和學生當中得到了肯定和好評，我們決定加大力度，借助亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室的大型儀器共享平臺，讓大型儀器全面支撐本科教學實驗，為我院學生畢業(yè)以后順利融入社會打下基礎。我們主要通過以下舉措來支撐本科實驗教學，提高學生的綜合素質:(1)定期舉辦大型儀器理論、操作培訓班，由有經驗的、熟悉大型儀器的管理人員任教，請儀器公司的工程師舉辦儀器專題講座，幫助學生解決實驗難題。(2)開設一門以大型儀器為主的課程——《大型儀器分析》作為選修課程，專門針對大型儀器的操作使用感興趣的學生。(3)將大型儀器融入到本科實驗中。考慮到現(xiàn)有大型儀器的情況及課程的銜接等因素，實驗老師對所有的本科實驗教材作了修改并進行了可行性分析。我們以生物技術專業(yè)作為試點，將蛋白組學研究相關實驗全面貫穿于本科實驗，涉及的大型儀器有液相色譜儀、蛋白純化儀、質譜儀、液質聯(lián)用儀、雙向電泳系統(tǒng)、酶解儀等，主要的實驗內容是分別從兩條路徑去鑒定蛋白質，雙向電泳－質譜和液相色譜－質譜，讓學生將理論與實踐相結合。由于大型儀器支撐的實驗過程復雜，實驗時間較長，對實驗人員的要求比較高，所以該部分實驗作為選修課程，學生可根據(jù)自己的興趣愛好來選擇。(4)大型儀器共享平臺向學生全天開放，讓感興趣的學生融入到科學研究中，使學生有更多的機會接觸大型儀器，提高實驗操作能力。

通過以上措施，讓廣大師生對國家重點實驗室的大型儀器有了充分的了解和認識，使他們的實驗操作技能有了大幅度的提高，從而提高學生的素質，提升實驗教學質量。

4 結束語

本科教學實驗的創(chuàng)新改革證明大型精密儀器設備資源完全可以用于支撐本科教學實驗。以大型儀器作為支撐，改變本科實驗設備簡陋問題，將本科教學中簡單的驗證性實驗變?yōu)榫C合性、研究性實驗，給予足夠空間讓學生琢磨、摸索、相互討論、學習。本科學生在校期間借助大型儀器完成各類綜合實驗，對于提高實驗技能、開拓專業(yè)視野及培養(yǎng)創(chuàng)新思維具有重要意義。同時，大型儀器應用于本科實驗教學也大大提高了儀器的使用率，在不與科研工作使用儀器沖突的情況下，合理安排時間，可以逐漸在本科實驗教學中加大大型儀器的使用頻率。

在實踐中我們也應該注意如下兩個事項:(1)綜合性實驗比單純的驗證性實驗要復雜，實驗方案、實驗人員的技術水平都會直接影響到實驗結果，相同的實驗，學生得到的實驗結果有時會相差很大。這就要求學生做實驗總結，把握實驗的關鍵點，動腦筋，勤思考，只有這樣才能從實踐中掌握實驗技術。(2)儀器昂貴，維護和維修成本比較高，綜合性實驗時間較長，還會使用到許多有毒試劑、藥品，要求老師要有較強的責任心，實驗過程中要全程跟蹤學生實驗，避免發(fā)生事故，損壞儀器。

總之，我們將不斷探索和實踐，在本科教學中利用國家重點實驗室的大型儀器來提高實驗教學質量，培養(yǎng)更多技術型人才。

［1］陳執(zhí)中.蛋白組學研究的新分析技術及其應用［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2011.

［2］Omenn G S.Strategies for plasma ptotemic profiling of cancers［J］.Proteomics，2006(6):5662 －5673.

［3］胡志遠，賀福初.蛋白質組研究進展［J］.生物化學與生物物理進展，1999，26(3):202－205.

［4］魏開華，應天翼.蛋白質組學實驗技術精編［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2010.

［5］謝青，吳元喜，劉筆峰，等.蛋白質雙向電泳實驗課的建設與實踐［J］.實驗科學與技術，2009，7(6):99－101.