大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型滑膜肽基精氨酸脫亞胺酶4表達(dá)

徐艷冰，王乃志，楊麗麗，崔華東，薛紅霞，張　寧

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第二風(fēng)濕免疫科，沈陽(yáng) 110001)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病。膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠與RA病理機(jī)制類(lèi)似，加之對(duì)自身免疫的敏感性，是常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚1]。

肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PADI4)是一種翻譯后修飾酶，可將精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基。PADI4在RA患者血清中含量明顯升高，在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自身抗PADI4抗體，并且PADI4瓜氨酸化多種蛋白質(zhì)引起機(jī)體自身的免疫反應(yīng)參與RA的發(fā)生與發(fā)展[2-5]。本研究擬在CIA大鼠模型上應(yīng)用PADI4特異性抗體，觀察其與CIA的相關(guān)性，探討PADI4在CIA不同時(shí)期發(fā)病中的作用，以為臨床診斷RA提供新的理論依據(jù)，并為RA治療提供方向。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

2012年7月至2013年5月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心將清潔級(jí)雌性Wistar大鼠[(體重為(100±20) g]30只(盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物部提供)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)選取6只為對(duì)照組，其余24只均建立CIA模型，其中6只模型建立失敗，其余關(guān)節(jié)炎模型建立成功且關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)>2分的18只大鼠隨機(jī)分為CIA3周模型組、CIA4周模型組及CIA6周模型組，每組6只。分別予以生理鹽水1 ml/d(對(duì)照組)、0.5 mg/ml雞Il型膠原(CIA模型組)皮內(nèi)注射，并于免疫后3，4，6周按組別處死。比較各組大鼠體重、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足趾容積及PADI4表達(dá)的變化情況。參考對(duì)照組評(píng)價(jià)PADI4與關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性。

主要藥品及試劑

雞Ⅱ型膠原(CCⅡ)及完全弗氏佐劑(CFA)為Sigma公司產(chǎn)品，PADI4抗體購(gòu)自NOVUS公司。

CIA模型建立

將用0.1 mol/L冰醋酸溶解的CCⅡ與等體積的CFA充分乳化，配成終濃度為0.5 g/L的乳劑。大鼠用水合氯醛(用量0.3 ml/100 g)麻醉后，模型組于大鼠背部及鼠尾根部多點(diǎn)皮下注射配制好的Ⅱ型膠原溶液，總量為1 ml。1周后上述方法、相同劑量再進(jìn)行1次。對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。

取材與包埋

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死大鼠，取左后足跖趾關(guān)節(jié)，10%多聚甲醛固定1周，脫鈣液(鹽酸加甲酸溶液)脫鈣，用大頭針檢測(cè)脫鈣滿意后，將關(guān)節(jié)常規(guī)脫水、包埋、切片；同時(shí)分離雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，立即放入液氮中，隨后-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

抗PADI4抗體測(cè)定

采集CIA模型鼠及正常對(duì)照組鼠靜脈血2 ml，離心后血清分裝，并于-80℃低溫冰箱保存待測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)PADI4抗體試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每板均設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。以正常對(duì)照組抗PADI4抗體濃度的第95百分位數(shù)的可信區(qū)間最大值定陽(yáng)性閾值。

免疫組織化學(xué)染色

跖趾關(guān)節(jié)標(biāo)本均用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，采用SP染色，經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，組織抗原熱修復(fù)。滴加一抗(1∶150的兔抗PADI4)后4℃冰箱孵育過(guò)夜；滴加二抗，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素，室溫孵育20 min。各步驟間以PBS沖洗5 min，連續(xù)3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。光鏡下觀察，胞膜或胞漿著棕黃或棕色者為陽(yáng)性表達(dá)。計(jì)算染色后PADI4表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。每個(gè)處理組做3張染片，每張染片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)非重疊視野(×400)下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。圖片采集設(shè)備為NIS-Elements F3.0，分析軟件為Nikon NIS-Elements BR3.0。

蛋白質(zhì)印跡Western blot檢測(cè)

采用不同時(shí)期CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜進(jìn)行。取保存于-80℃中的膝關(guān)節(jié)滑膜，加入適量裂解液裂解滑膜組織，超聲破碎儀破碎組織后取上清，采用BCA Protein Assay Kit測(cè)蛋白濃度后，每個(gè)樣品均調(diào)整為40 μg/μl的蛋白終濃度，每孔上樣20 μl后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電壓強(qiáng)度為80 V，電泳1 h后，改為120 V，電泳2 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電轉(zhuǎn)移的條件設(shè)定為恒電壓100 V，2 h。然后將PVDF膜浸泡入5%的脫脂牛奶中2 h，加入一抗后4℃孵育過(guò)夜(1∶1 000的兔抗PADI4，1∶15000鼠抗GAPDH)。復(fù)溫30 min，TBST洗膜后加入二抗(1∶5 000的辣根過(guò)氧化物酶驢抗兔/小鼠IgG)室溫下孵育2 h，TBST洗膜后進(jìn)行ECL顯色反應(yīng)、曝光、顯影、過(guò)水、定影。

觀察指標(biāo)

一般情況觀察：大鼠體毛色澤、活動(dòng)狀態(tài)、排便及食量的變化情況并每周測(cè)定大鼠體重。

AI：根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹、顏色及關(guān)節(jié)活動(dòng)情況記錄并評(píng)價(jià)大鼠全身關(guān)節(jié)病變程度，每7天評(píng)定1次，共評(píng)定6次。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)紅腫；1分，小趾關(guān)節(jié)稍腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪腫脹。四肢肢體的病變程度累積積分為AI，最高為16分。

足趾容積測(cè)定：根據(jù)排水法原理，用自制的關(guān)節(jié)容積測(cè)量器測(cè)量大鼠左后足雙踝連線以下全足容積，每周測(cè)量1次，共測(cè)6次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一般情況

致敏后約第14天大鼠足部及踝關(guān)節(jié)皮膚開(kāi)始發(fā)紅，輕度腫脹，關(guān)節(jié)炎開(kāi)始形成。約第28天左右，關(guān)節(jié)腫脹達(dá)高峰，體重增長(zhǎng)緩慢(表1)。左側(cè)足趾容積變化見(jiàn)表2。

血清抗PADI4抗體水平及陽(yáng)性率比較

CIA組血清中抗PADI4抗體陽(yáng)性率為44.4%(8/18)，高于對(duì)照組16.67%(1/6)，兩組陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

免疫組織化學(xué)染色

PADI4在骨組織和滑膜中的分布基本相同。陽(yáng)性表達(dá)主要位于軟骨周邊單核細(xì)胞、侵潤(rùn)細(xì)胞胞漿及骨髓腔中，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，且染色亦深于對(duì)照組(圖1)。

CIA組初次免疫3、4、6周后骨組織中PADI4蛋白陽(yáng)性細(xì)胞染色光密度值分別為(0.2898±0.0120)、(0.2982±0.0220)、(0.2974±0.0310)，明顯高于對(duì)照組(0.2530±0.0127)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。初次免疫后第3周，部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量PADI4陽(yáng)性表達(dá)；第4周時(shí)PADI4表達(dá)明顯增多，隨著病情的進(jìn)展，其表達(dá)有所減少。

蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果

初次免疫后第3周，可見(jiàn)PADI4陽(yáng)性表達(dá)條帶；第4周PADI4蛋白表達(dá)條帶強(qiáng)度最深，隨后其表達(dá)水平降低；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，即第6周仍有陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。

討　　論

表1各組大鼠實(shí)驗(yàn)不同階段體重變化

分組0d7d14d21d28d42d對(duì)照組111 00±5 10155 50±3 11183 25±6 13197 50±6 36251 00±5 19257 01±3 89膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型組112 17±11 16152 33±12 39169 00±13 80190 00±22 63207 00±33 94247 50±42 97

表2各組大鼠實(shí)驗(yàn)不同階段左側(cè)足趾容積變化

分組0d7d14d21d28d42d對(duì)照組1 263±0 0761 335±0 1011 447±0 1011 522±0 1561 630±0 1371 707±0 124膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型組1 255±0 1301 355±0 0831 472±0 1041 963±0 1342 421±0 1202 290±0 121

RA以關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)為特征，疾病多呈漸進(jìn)型發(fā)展。早診斷、積極治療是預(yù)防控制RA病情發(fā)展的前提，但是鑒別診斷RA和其他自限性疾病比較困難，確診RA往往要在數(shù)月甚至數(shù)年之后，易造成不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)節(jié)畸形和強(qiáng)直，致殘率較高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anticyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP)是目前特異性相對(duì)最好的早期診斷指標(biāo)之一，能在出現(xiàn)臨床癥狀之前就出現(xiàn)并可被檢測(cè)到，對(duì)于早期、非典型、類(lèi)風(fēng)濕因子陰性的RA患者有較大的診斷價(jià)值，且與RA的嚴(yán)重程度相關(guān)。肽酰精氨酸脫亞胺基酶(peptidylarginine deiminase，PADI)是催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的關(guān)鍵性酶，其基因多態(tài)性也因此成為研究RA易感性和發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)[6-8]。在RA患者體內(nèi)，PADI蛋白本身也可以成為自身抗體的目標(biāo)[9-11]，并且可能在原位形成免疫復(fù)合物促進(jìn)了炎性反應(yīng)[12]。RA患者血清中存在特異性抗PADI4抗體，陽(yáng)性率為50%，與病情程度相關(guān)[9-10]。國(guó)內(nèi)研究顯示，抗PADI4抗體對(duì)RA診斷的敏感性為45%，特異性為93.5%，RA患者血清中抗PAID4抗體的陽(yáng)性率是45%，抗PADI4抗體與病情活動(dòng)指病活動(dòng)性評(píng)分和抗CCP抗體具有相關(guān)性[13]。Shi等[14]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，50%類(lèi)風(fēng)濕因子陰性RA患者中抗PADI4抗體陽(yáng)性，43%抗角蛋白抗體陰性患者中抗PADI4抗體呈陽(yáng)性，60% CCP陰性患者中抗PADI4抗體陽(yáng)性。以上結(jié)果表明抗PADI4抗體是RA特異性較高的抗體，尤其在類(lèi)風(fēng)濕因子、抗角蛋白抗體和抗CCP抗體陰性RA患者中有較高診斷價(jià)值。有研究顯示RA患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗PADI4抗體以IgG1和IgG3兩個(gè)亞群為主[15]，主要識(shí)別PADI4的4個(gè)線性肽段，即N端序列P22(211～230)、P28(271～290)，C端序列P61(601～620)、P63(621～640)，自身抗體可能是通過(guò)阻止PADI4與鈣離子和底物的結(jié)合從而抑制PADI4介導(dǎo)的纖維蛋白原瓜氨酸化過(guò)程[16]。然而RA患者自身如何產(chǎn)生抗PADI4抗體的機(jī)理尚未明了，一種可能是機(jī)體在對(duì)瓜氨酸蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)之后通過(guò)表位擴(kuò)展進(jìn)而產(chǎn)生了抗PADI4抗體；另一種可能是某種基因亞型的患者體內(nèi)PADI4表達(dá)增加，進(jìn)而打破免疫耐受產(chǎn)生抗體[13]?？筆ADI4抗體是否參與或如何參與RA發(fā)展過(guò)程并未闡明?？梢钥隙ǖ氖?，PADI4與RA的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)，可能是RA的致病抗原之一。PADI4或抗PADI4抗體可以成為新的臨床輔助檢測(cè)標(biāo)志物，但是對(duì)于PADI4如何打破免疫耐受仍然未知。

CIA是于1977年發(fā)現(xiàn)，因其臨床表現(xiàn)、關(guān)節(jié)病理、細(xì)胞及體液免疫等方面與人類(lèi)RA接近，被廣泛用于RA發(fā)病機(jī)制及藥物評(píng)價(jià)等方面的研究，是目前比較理想的RA模型[17]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)想若鼠關(guān)節(jié)炎模型與人RA中PADI4的表達(dá)情況相似，從而可更方便、簡(jiǎn)潔、有效的進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)。對(duì)PADI4研究的深入不僅有助于理解翻譯后修飾在生命過(guò)程中的重要意義，還可以對(duì)未來(lái)藥物的開(kāi)發(fā)提供新的方向。而且PADI4與RA相關(guān)性的研究對(duì)闡明RA的發(fā)病機(jī)制和RA的診斷有著十分重要的意義，有可能為RA的治療開(kāi)辟新途徑。

本研究顯示，在CIA發(fā)病的早期即初次免疫后第3周，PADI4即處于陽(yáng)性表達(dá)狀態(tài)，早于臨床癥狀即關(guān)節(jié)腫脹之前出現(xiàn)，隨后PADI4表達(dá)逐步升高，到初次免疫后第4周達(dá)到高峰，后略有降低，但直到6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，PADI4仍處于較高水平的陽(yáng)性表達(dá)狀態(tài)。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在CIA發(fā)病過(guò)程中，PADI4在疾病發(fā)展過(guò)程中處于早期陽(yáng)性狀態(tài)。通過(guò)本研究結(jié)果可以推測(cè)，抑制PADI4基因表達(dá)有望用于RA的治療，但蛋白的復(fù)制翻譯轉(zhuǎn)錄是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，各途徑之間存在各種交互聯(lián)系，相互協(xié)同、相互制約共同介導(dǎo)RA病理過(guò)程，因此，還需要大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步研究。因此，抑制PADI4基因表達(dá)能否用于RA的治療，還需要大量的動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

(本文圖1、2見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ)

[1]龍桂芳， 阿卜迪. 用PCR-SSP方法研究廣西壯族H LA-DQA1和B1基因多態(tài)性[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志， 1999， 19：504-505.

[2]Vossenaar ER，Zendman AJ，van Nenrooij WJ，et al. PAD，a growing family of citrullinating enzymes：genes，features and involvement in disease[J].Bioessays，2003，25：1106-1118.

[3]Fujisaki M，Suqawara K. Properties of petidylarginine deiminease from the epidermis of newborn rats[J].J Biochem，1981，89：257-263.

[4]Iida A，Nakamura Y. Identification of 45 novel SNP in the 83Kb region containing peptidylarginine deiminase types 1 and 3 loci on chromosomal band 1P36. 13[J].J Hum Genet，2004，49：387-390.

[5]Guerrin M，shigami A，Mechin MC，et al. cDNA cloning，gene organization and expression analysis of human peptidylarginine deiminase type I[J].Biochem J，2003，370：167-174.

[6]Suzuki A， Yamada R， Chang X， et al. Functional haplotypes of PADI4，encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4， are associated with rheumatoid arthritis[J].Nat Genet， 2003，34：395-402.

[7]Ikari K， Kuwahara M， Nakamura T， et al. Association between PADI4 and rheumatoid arthritis：a replication study[J].Arthritis Rheum， 2005， 52：3054-3057.

[8]Takata Y， Inoue H， Sato A， et al. Replication of reported genetic associations of PADI4， FCRL3， SLC22A4 and RUNX1 genes with rheumatoid arthritis：results of an independent Japanese population and evidence from meta-analysis of East Asian studies[J].J Hum Genet， 2008， 53：163-173.

[9]Takizawa Y，Sawada T，Suzuki A，et al. Peptidylargininedeiminase 4 (PADI4) identified as a conformation-dependent autoanti-gen in rheumatoid arthritis[J].Scand J Rheumatol，2005，34：212-215.

[10] Harris ML， Darrah E， Lam GK， et al. Association of autoimmunity to peptidyl arginine deiminase type 4 with genotype and disease severity in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2008，58：1958-1967.

[11] Halvorsen EH，Pollmann S，Gilboe IM，et al. Serum IgG antibodies to peptidylarginine deiminase 4 in rheumatoid arthritis and associations with disease severity[J].Ann Rheum Dis，2008，67：414-417.

[12] Anzilotti C，Pratesi F，Tommasi C，et al. Peptidylarginine deiminase 4 and citrullination in health and disease[J].Autoimmun Rev，2010，9：158-160.

[13] Zhao J，Zhao Y，He J，et al. Prevalence and significance of anti-peptidylarginine deiminase 4 antibodies in rheumatoid arthritis[J].J Rheumatol，2008，35：969-974.

[14] Shi HX，Qian L，Li XP，et al. The significance of serum anti-peptidylarginie deiminase 4 antibodies in the diagnosis of rheumatoid arthritis[J].Immunol J，2010，26：329-332.

[15] Wang W，Li J. Predominace of IgG1 and IgG3 subclasses of autoantibodies to peptidylarginine deiminase 4 in rheumatoid arthritis[J].Clin Rheumatol，2011，30：563-567.

[16] Auger I，Martin M，Balandraud N，et al. Rheumatoid arthritis specific autoantibodies to peptidyl arginine deiminase type 4 inhibit citrullination of fibrinogen[J].Arthritis Rheum，2010，62：126-131.

[17] Morel J，Audo R，Hahne M，et al.Tumor neerosis faetor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)induces rheumatoid arthritis syovial fibroblast proliferation through mitogen-activated protein kinases and phosphatidylinositol 3-kinaseAkt[J].J Biol Chem，2005，280：15709-15718.