α-乙酰乳酸脫羧酶克隆表達方法

賀艷，張裕君，趙天來，趙衛(wèi)東，鄭文杰，史光華，趙璟源，劉躍庭，劉偉，張霞

（1.天津出入境檢驗檢疫局，天津300461；2.中國合格評定國家認可中心，北京100062）

α-乙酰乳酸脫羧酶克隆表達方法

賀艷1，張裕君1，趙天來1，趙衛(wèi)東1，鄭文杰1，史光華2，趙璟源1，劉躍庭1，劉偉1，張霞1

（1.天津出入境檢驗檢疫局，天津300461；2.中國合格評定國家認可中心，北京100062）

雙乙酰是啤酒生產(chǎn)工藝中重要的風(fēng)味物質(zhì)，為控制啤酒生產(chǎn)中雙乙酰的含量，縮短啤酒熟化時間，基因工程技術(shù)改造啤酒酵母已應(yīng)用得非常廣泛。綜述國內(nèi)外基因工程技術(shù)克隆表達方法，介紹檢測策略。

α-乙酰乳酸脫羧酶；克隆；檢測

雙乙酰是啤酒生產(chǎn)工藝中重要的風(fēng)味物質(zhì)，但如果雙乙酰含量超過0.15 mg/L時就能產(chǎn)生令人不愉快的餿飯味，嚴重影響啤酒的品質(zhì)。啤酒成熟的重要標準是雙乙酰濃度在其口味閾值以下（0.02mg/L～0.10mg/L）。啤酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的雙乙酰來源復(fù)雜[1]，主要是啤酒代謝的產(chǎn)物α-乙酰乳酸經(jīng)非酶氧化脫羧產(chǎn)生。α-乙酰乳酸是纈氨酸代謝的中間產(chǎn)物，原因是丙酮酸經(jīng)乙酰乳酸合成酶形成α-乙酰乳酸，而催化α-乙酰乳酸還原成二羥基異戊酸的乙酰乳酸還原異構(gòu)酶的效率非常低，使α-乙酰乳酸得到積累，α-乙酰乳酸分泌到胞外后，通過非酶氧化脫羧形成雙乙酰，雙乙?？稍龠M入酵母細胞被還原成乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）和2，3-丁二醇。另外，α-乙酰乳酸還可以在α-乙酰乳酸脫羧酶的催化下直接形成乙偶姻和2，3-丁二醇。這兩種物質(zhì)的口味閾值均較高，對啤酒風(fēng)味的影響比雙乙酰小得多。如果在成熟階段α-乙酰乳酸不能被充分除去，在隨后的啤酒包裝、殺菌過程中會有較多的雙乙酰形成。這樣α-乙酰乳酸反而成了啤酒成熟的時間限制因素。所以在啤酒成熟過程中加入雙乙酰還原酶并不能有效降低雙乙酰，而α-乙酰乳酸脫羧酶卻可以很好的達到這一目的。

在實際生產(chǎn)中，控制啤酒產(chǎn)品的雙乙酰含量的重點主要放在發(fā)酵階段，當啤酒釀造過程進入儲存階段后，雙乙酰的還原速度減慢，特別是進入低溫階段以后，雙乙酰含量幾乎沒有什么變化。因此，在啤酒釀造進入低溫階段以前盡可能地降低雙乙酰的含量十分重要。因此，若將該酶制劑應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)，在啤酒發(fā)酵階段或后熟階段加入。則可大大縮短啤酒后熟期，提高設(shè)備利用率和節(jié)省能源，產(chǎn)生極大的經(jīng)濟效益。

α-乙酰乳酸脫羧酶可將雙乙酰的前體α-乙酰乳酸快速催化分解為乙酰姻，從而降低啤酒中殘留的α-乙酰乳酸，防止成品酒中的雙乙酰的反彈，同時可以使啤酒的成熟度大大提高。天然的啤酒酵母細胞中不存在合成α-乙酰乳酸脫羧酶的相關(guān)基因。Gostfredsen等[2]首先報導(dǎo)用ALDC可加速啤酒的熟化。

目前人們采用基因工程改造技術(shù)來降低啤酒中的雙乙酰，其主要做法是在酵母菌中表達編碼α-乙酰乳酸脫羧酶基因或者在啤酒生產(chǎn)中加入α-乙酰乳酸脫羧酶制劑。本文綜述了利用基因工程技術(shù)改造啤酒酵母使其合成α-乙酰乳酸脫羧酶（α-acetolactate decarboxylase，ALDC，EC.4.1.1.5）降低雙乙酰的前體α-乙酰乳酸的含量從而達到降低啤酒中雙乙酰含量的方法，并介紹其檢測策略。

1 α-乙酰乳酸脫羧酶克隆表達

丹麥Carlsberg實驗室的科學(xué)家Godtfredsen等在1982年率先開展α-乙酰乳酸脫羧酶的研究工作，產(chǎn)氣腸桿菌1033菌株能夠產(chǎn)生α-乙酰乳酸脫羧酶，通過純化得到該酶純品，并進行加速啤酒成熟的試驗。將α-乙酰乳酸脫羧酶加入到新釀制的啤酒中，在10℃保溫24 h，啤酒中的雙乙酰含量大大降低，其含量在味閾值以下，啤酒的主要指標和感官性質(zhì)與常規(guī)熟化三周的啤酒相同，啤酒的成熟期明顯的縮短。此后，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種可產(chǎn)生α-乙酰乳酸脫羧酶的微生物有產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、短芽孢桿菌（Bacillus brevis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、克雷伯氏土生菌（Klebsiella terrigena）、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）等。

Diderichsen等[3]根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成探針，PCR擴增獲得短芽孢桿菌ATCC11301的α-乙酰乳酸脫羧酶，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和醋化醋桿菌，均獲得了表達。大腸桿菌中ALDC的表達是在細胞內(nèi)，其中30%位于周質(zhì)空間。而在醋化醋桿菌中74%的活性在細胞外。

Garmyn等[4]用微孔板篩選法克隆到了釀酒球菌的α-乙酰乳酸脫羧酶，并獲得了高于供體菌的酶活表達。序列分析表明，該基因位于乙酰乳酸合成酶基因的下游，這兩個基因位于同一操縱元內(nèi)，這一結(jié)構(gòu)同醋化醋桿菌類似。

Sone等[5]以酵母自主復(fù)制型載體（YRp）為基礎(chǔ)，用包含啟動子為酵母乙醇脫氫酶I（ADH1），產(chǎn)氣腸桿菌的α-乙酰乳酸脫羧酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化淡啤酒酵母K1084并獲得了高效表達，每毫克蛋白有2個～3個ALDC活力單位。

Fujii等[6-7]基于含有酵母核糖體DNA的酵母整合型質(zhì)粒YIp5構(gòu)建的質(zhì)粒含有產(chǎn)氣腸桿菌α-乙酰乳酸脫羧酶基因、酵母乙醇脫氫酶（ADH1）啟動子、組氨酸透性酶（HIP1）終止子、G418抗性基因及rDNA同源重組序列。將轉(zhuǎn)化菌株在非選擇培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，分離出只保有α-乙酰乳酸脫羧酶表達盒而不含有不需要的載體序列的轉(zhuǎn)化菌株，得到了刪除標記的含有20個以上α-乙酰乳酸脫羧酶拷貝的重組菌株。

Yamano等[8-9]將木醋桿菌（Acetobacter aceti ssp. xylinum）的α-乙酰乳酸脫羧酶分別克隆到酵母游離質(zhì)粒YEp和酵母整合質(zhì)粒YIp中，用大致相同的策略得到了整合α-乙酰乳酸脫羧酶基因的酵母轉(zhuǎn)化株，并獲得了穩(wěn)定高效表達。同時比較了不同的啟動子對ALDC基因在啤酒酵母中表達所起的作用。實驗表明含有磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動子的ALDC基因表達水平比乙醇脫氫酶（ADH1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GPD）均高。

Goelling等[10]構(gòu)建的ALDC表達酵母菌株包括巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）α-乙酰乳酸脫羧酶基因，乙醇脫氫酶（ADH1）啟動子。發(fā)酵試驗結(jié)果顯示，總雙乙酰含量明顯下降，其它發(fā)酵特征無明顯變化。為了得到穩(wěn)定表達ALDC且易于被公眾接受的重組酵母菌株，Stahl等[11]去除了同α-乙酰乳酸脫羧酶基因相連的抗生素基因，通過同源重組將α-乙酰乳酸脫羧酶基因整合在酵母染色體上。

郭文潔等[12]用Bam HI和Eco RI雙酶切質(zhì)粒pCM1-1，回收CUP1啟動子和銅抗性基因片段，然后再用這兩種酶雙酶切pBG4，回收ALDC基因的片段。整合型穿梭YIp5用BamHI酶切線性化，堿性磷酸酶處理，構(gòu)建了質(zhì)粒pCMA2-1，具有銅抗性基因的表達載體，用完整細胞轉(zhuǎn)化法將表達載體轉(zhuǎn)化啤酒生產(chǎn)酵母菌株，并實現(xiàn)了功能性表達。

李聯(lián)正等[13]設(shè)計了α-乙酰乳酸脫羧酶基因的兩組引物，ALDC全長的上游引物為：ggggtacccgtcaaggcatgaacgc，下游引物為：cgggatcccatcagaccacacctttac，上下游引物中分別加入了KpnI和Bam HI位點；ALDC結(jié)構(gòu)基因的上游引物為：catgccatggaacgagaaagcaac，下游引物為：gaagatcttattcagggcttccttc，上下游引物中分別加入了NcoIBglII以枯草芽孢桿菌168為模版，PCR擴增獲得ALDC基因。將該基因克隆到表達載體pQE60中，構(gòu)建了pQE60-ALDC，其啟動子為T5。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能夠高表達ALDC。對該酶進行了活力測定，結(jié)果顯示工程菌產(chǎn)酶活力為0.11U/mL。

李聯(lián)正等[14]設(shè)計了上游引物：ccgctcgagaaaagaaaacgagaaagcaacattc和下游引物cggaattcttattcagggcttccttc，分別引入了XhoI和Eco RI位點，PCR獲得ALDC，ALDC基因和大腸桿菌-畢赤酵母穿梭載體pPIC9雙酶切后連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC-ALDC。SacI線性化重組質(zhì)粒DNA后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。SDSPAGE分析可見到相對分子量約62 000的表達條帶，經(jīng)測定表達產(chǎn)物活力為0.03U/mL。

茍幫超等[15]根據(jù)已知的α-乙酰乳酸脫羧酶基因序列，在上游引物引入Eco RI，在下游引物引入Bam HI酶切位點，具體序列分別為，上游引物caggaattcatgatgcactcatctgcctggac，下游引物：gcggatccgcccactgacgtgactgtttc。退火溫度為50℃，利用PCR方法從產(chǎn)氣大腸桿菌（Enterobacter aerogenes）中克隆到0.8 kb的DNA片段，經(jīng)DNA序列分析表明該DNA片段為ALDC基因，僅186位堿基a被c替代，密碼子acc替代aca，替代后仍然是蘇氨酸。將該片段插入到原核表達載體pBV220中，獲得表達質(zhì)粒pBVEDAD，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（Escherichia coli），經(jīng)熱誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE分析和酶活測定，結(jié)果表明ALDC獲得了高效表達。

秦玉靜等[16]用Bam HI部分酶切含α-乙酰脫羧酶基因的地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis AS10106的染色體DNA，pUC19質(zhì)粒也用BamHI酶切后轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到4 800個重組轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子中均含有4 kb～10 kb的外源插入DNA片段。篩選出含有α-乙酰乳酸脫羧酶基因的質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化JM109，利用酵母穿梭質(zhì)粒pYES2為載體，啟動子為GAL1，可以將α-乙酰脫羧酶基因引入釀酒酵母中，從而使重組酵母菌株具有降解啤酒發(fā)酵中生成的α-乙酰乳酸，減少雙乙酰含量的能力。

沈亮等[17]用PCR方法擴增乙酰短桿菌α-乙酰乳酸脫羧酶基因（ALDC），得到0.78 kb的DNA片段。將回收到的ALDC基因用Bam HI和Eco RI雙酶切后，重組到表達載體pQE-9中，在大腸桿菌JM109中得到高效表達，用IPTG，40℃誘導(dǎo)并進行SDS-PAGE，結(jié)果表明該基因已表達，表達量占總蛋白的40%。

王愛娥等[18]等根據(jù)已知α-乙酰脫羧酶的基因序列，設(shè)計了兩條引物，在上游引物的5’端分別加上Bam HI和下游引物加入Eco RI的識別位點，上游引物gcagaattcatgcactcatctggcctgcgac，下游引物gcaggatccgcccactgacgtgactgtttc，用PCR法從產(chǎn)氣腸桿菌（Ebterobacter aerogenes）中克隆到約0.8 kb的DNA片段，經(jīng)DNA測序證明是ALDC基因，將該基因重組到相同酶切過的質(zhì)粒pBV220中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實現(xiàn)了高表達，獲得了目的蛋白表達量約50%的轉(zhuǎn)化子。

廖東慶等[19]用P43啟動子的引物，上游引物為attgctggacgcttatggac，下游引物為：cgggatccattcctctcttac，經(jīng)過PCR擴增獲得枯草芽孢桿菌啟動子P43。將P43和質(zhì)粒pUC19-ALDC同時用Bam HI和HindIII雙酶切后，鏈接得到重組質(zhì)粒pUC19-P43-ALDC，其中P43啟動子和α-乙酰乳酸脫羧酶基因之前。由于pUC19-P43-ALDC與質(zhì)粒pMLK83-BN有兩段同源臂，因此通過同源雙交換將ALDC插入到了amyB位點，篩選得到具有新霉性抗性且無淀粉酶活性的枯草芽孢桿菌的重組菌株。

張燎原等[20]運用生物信息學(xué)和PCR方法，設(shè)計的引物為上游引物：cgcggatccatgaacgaaaaacacgggt，下游引物為：cccaagcttagccctcgfcggaacgaat，上游引物加入Bam HI酶切位點，下游引物加入HindIII酶切位點，鑒定了粘質(zhì)雷氏菌乙偶姻生物合成突進中編碼α-乙酰脫羧酶序列。經(jīng)測序和序列分析顯示α-乙酰乳酸脫羧酶基因的開放閱讀框（ORF）長度為780 bp，編碼259個氨基酸，編碼蛋白分子量和等電點氛圍為28.96 kDa和5.48，屬酸性蛋白。將基因用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后，克隆至pET28a（+）表達載體中，并轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）。IPTG，30℃誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE結(jié)果表明在大約29 kDa的位置出現(xiàn)了特異性蛋白條帶，表明α-乙酰脫羧酶基因在E.coli BL21（DE3）中獲得了高效的表達。

張沛等[21]用Bam HI/Eco RI和Eco RI/SacI酶切質(zhì)粒pCM1-1，分別回收CUP1啟動子片段和銅抗性片段（MTI），與Bam HI/Eco RI酶切質(zhì)粒pBC4，回收約2 kb，含枯草芽孢桿菌α-乙酰乳酸脫羧酶基因，整合型穿梭載體YIp5經(jīng)Bam HI酶切線性化，堿性磷酸酶處理。構(gòu)建了重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化子測定α-乙酰乳酸脫羧酶活性測定結(jié)果表明質(zhì)粒能高效表達該酶。

2 檢測策略

檢測中用的方法通常包括結(jié)構(gòu)特異性檢測和品系特異性檢測。基因工程技術(shù)涉及到的載體有大腸桿菌，酵母菌和醋化醋桿菌，而且克隆技術(shù)各不同，在篩查檢測中可以選用結(jié)構(gòu)特異性檢測，針對α-乙酰乳酸脫羧酶基因設(shè)計特異的上下游引物及探針。而對于某種基因工程技術(shù)生產(chǎn)的酶制劑的檢測，則可以選用品系特異性檢測。同時考慮到酶制劑在加工過程中會有極端條件，則可以選用短片段100 bp至300 bp為檢測目標。另外，檢測方法的檢測靈敏度需要低于0.02mg/L，這樣才能有效地對酶制劑甚至是用酶制劑生產(chǎn)的啤酒進行有效監(jiān)管。

[1]Wainwright T.Diacetyl:a review[J].Inst Brew,1973,79:451-470

[2]Loken JP,Stormer FC.Acetolactate decarboxylase from Aerobacter aerogenes:Purification and Properties[J].Eur J Biochem,1970,14: 133-137

[3]Diderichsen B,U Wedsted,L Hedegaard,et al.Cloning of a1dB, which encodesα-acetonlactate decarboxylase,an exoenzyme from Bacillus brevis[J].Bacteriol,1990,172(8):4315-4321

[4]Garmyn D,C Monnet,B Martineau,et al.Cloning and sequencing of the gene encodingα-acetonlactate decarboxylase from Leucosnotoc oenos[J].FEMS Microbiol Lxt,1996(145):445-450

[5]Sone H J,Tanaka,TInoue,DNA strand coding forα-acetonlactate decarboxylase and yeast transformed with the DNA strand:EP 0228009A2[P/OL].1987-07-08.http://www.google.com.tr/patents/ EP0228009A2?cl=en

[6]Sone H,T Fujii,K Kondo,et al.Nucleotide sequence and expression of theα-acetonlactate decarboxylase gene in brewer’s yeast[J].Appl Environ Microbrol,1988,54(1):38-42

[7]Hidetaka Sone,Toshio Fujii.Molecular cloning of the gene encoding α-acetonlactate decarboxylase from Enterobacter aerogenes[J]. Journal of biotechnology,1987,5:87-91

[8]Yamano S,K Tomizuka,H Sone,et al.Brewing performance of a brewer’s yeast havingα-acetonlactate decarboxylase from Acetobacteraceti ssp.xylinum[J].Biotechnol,1995(39):21-26

[9]Yamamo S,K Tomizuka,JTanakca,et al.High level expression of α-acetonlactate decarboxylase gene from Acetobacter aceti ssp. xylirum in brewing[J].Biotechnol,1994(37):45-48

[10]Goelling D,U Stahl.Expression of the decarboxylase gene in yeast, Yeast[J].1992,8:161-163

[11]Goelling D,U Stahl.Cloning and expression of anα-acetonlactate decarboxylase gene from Streptococcus Lactis subsp.Diacetylactis in Escherichia coli[J].Appl Environ Microbrol,1988,54(7):1889-1891

[12]郭文潔,何秀萍,鐵翠娟,等.枯草芽孢桿菌α-乙酰乳酸脫羧酶基因在啤酒酵母工業(yè)菌株中的表達[J].微生物學(xué)報2001,41(1): 105-108

[13]李聯(lián)正,張惟材,汪建華,等.α-乙酰乳酸脫羧酶在大腸桿菌中的克隆表達[J].生物技術(shù)通訊,2005,16(6):618-620

[14]李聯(lián)正,張惟材,汪建華,等.α-乙酰乳酸脫羧酶在畢赤酵母菌中的分泌表達[J].生物技術(shù)通訊,2005,16(6):621-623

[15]茍幫超,葉盛,李維,等.產(chǎn)氣腸桿菌α-乙酰乳酸脫羧酶基因的克隆和表達[J].四川師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2006,29(6):739-742

[16]秦玉靜,高東,王組農(nóng).α-乙酰乳酸脫羧酶的基因克隆及在大腸桿菌和釀酒酵母中的表達[J].遺傳學(xué)報,2000,27(2):165-169

[17]沈亮.乙酰短桿菌α-乙酰乳酸脫羧酶基因的克隆及其表達[J].德州學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2005,21(4):5-7

[18]王愛娥,蔭俊.產(chǎn)氣腸桿菌α-乙酰乳酸脫羧酶基因的克隆表達及鑒定[J].生命科學(xué)研究,2003,7(4):310-314

[19]廖東慶,陳發(fā)忠,岳田芳,等.α-乙酰乳酸脫羧酶基因在枯草芽孢桿菌中的整合型表達[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2010,29(5): 843-848

[20]張燎原,孫健安,魏東芝,等.粘質(zhì)沙雷氏菌中乙偶姻合成途徑基因克隆、測序分析及表達[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,33(5): 987-992

[21]張沛,張博潤.含α-乙酰乳酸脫羧酶基因的啤酒酵母工程菌的構(gòu)建[J].釀酒,2004,31(3):97-99

Cloning and Expression Methods of α-acetolactate Decarboxylase Gene and Detection Strategy

HE Yan1，ZHANG Yu-jun1，ZHAO Tian-lai1，ZHAO Wei-dong1，ZHENG Wen-jie1，SHI Guang-hua2，ZHAO Jing-yuan1，LIU Yue-ting1，LIU Wei1，ZHANG Xia1
（1.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quanrantine Bureau，Tianjin 300461，China；2.China National Accreditation Service for Conformity Assessment，Beijing100062，China）

Diacetyl is the important flavour in beer processing technique.In order to lower diacetyl concentration in beer production，shorten fermentation time of beer，gene modified technology is commonly used to introduce α-acetolactate decarboxylase gene into beer yeast strain.The different cloned methods and express methods were reviewed.The detection strategy was formed.

α-acetolactate decarboxylase；clone；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.036

2013-10-12

賀艷（1978—），女（漢），高級工程師，碩士，研究方向：植物保護。