附子藥代動力學研究進展

楊曉珊 吳錦俊 盧琳琳 朱麗君 劉中秋

（廣州中醫(yī)藥大學國際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究所，廣州，510006）

附子藥代動力學研究進展

楊曉珊 吳錦俊 盧琳琳 朱麗君 劉中秋

（廣州中醫(yī)藥大學國際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究所，廣州，510006）

附子為毛茛科多年生草本植物烏頭子根的加工品，具有局麻、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、強心、抗炎、抗腫瘤等功效，廣泛用于治療跌打損傷，風濕關節(jié)炎，腫瘤等疾病。由于在臨床使用過程中不良反應和中毒事件頻頻發(fā)生，近年來對附子提取物及其有效／有毒成分的藥代動力學研究甚多，作者對此研究近況做一綜述。

附子；藥代動力學

附子（Aconitum carmichaeliDebx）為毛茛科多年生草本植物烏頭子根的加工品，具有局麻、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、強心、抗炎、抗腫瘤等功效，主要用于治療跌打損傷，風濕關節(jié)炎腫瘤等疾病。從化學成分上看，烏頭屬植物中的主要成分是二萜生物堿，約占總重的7%～10%，具有顯著的藥理活性，同時也是毒性成分。附子中二萜類生物堿主要有三種：雙酯型二萜類生物堿、單酯型二萜類生物堿和原堿型二萜類生物堿。在我國，附子作為藥用植物應用于臨床已有二千多年的歷史，然而由于其治療劑量和中毒劑量非常接近，在臨床使用過程中不良反應和中毒事件頻頻發(fā)生，限制其廣泛應用。所以，近年來國內(nèi)外研究者從附子提取物及其活性／毒性成分的藥代動力學方面入手，研究其發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎以它對機體的影響。

1 附子提取物藥動學研究

近年來，人們利用現(xiàn)代檢測技術從動物整體水平上，對附子提取物的吸收代謝特征進行了大量研究，為附子的臨床安全應用提供了許多重要信息。

Pen等[1]大鼠灌胃附子水提物（0.45 g／kg）后，測定了大鼠體內(nèi)烏頭堿（Aconitine，AC）、中烏頭堿（Mesaconitine，MA）、次烏頭堿（Hypaconitine，HA）、苯甲酰烏頭原堿（Benzoylaconine，BAC）、苯甲酰中烏頭原堿（Benzoylmesaconine，BMA）和苯甲酰次烏頭原堿（Benzoylhypaconine，BHA）的血藥濃度，它們在大鼠體內(nèi)的達峰時間（Tmax）分別為41.39、56.39、70.53、35.18、24.68和26.79 min。其半衰期（T1／2）分別為220、192.06、252.93、186.62、138.11和70.20 min。說明附子提取物中烏頭類生物堿在大鼠體內(nèi)吸收迅速，并且代謝較快，經(jīng)過24 h后，在體內(nèi)殘留極少，無蓄積現(xiàn)象。Zhang等人[2]在受試者靜脈滴注不同劑量的“參附注射液”，發(fā)現(xiàn)AC、MA和HA在人體血液中濃度極低，幾乎檢測不到。而三種苯甲酰烏頭類生物堿則呈現(xiàn)較高的血藥濃度（BMA＞BHA＞BAC），三者的半衰期皆在1 h內(nèi)，且在45 min內(nèi)都達到血藥濃度峰值。

此外，附子治療風濕性關節(jié)炎等慢性疾病，常要求多劑量給藥，以達到有效的血藥濃度，但同時也可能引起蓄積中毒。唐斕等[3]經(jīng)大鼠灌胃給藥附子醇提物，結果表明多劑量給藥后烏頭堿的達峰時間（Tmax）快于單劑量給藥，而吸收程度（AUC）為單劑量給藥的1.5倍，且烏頭堿的血漿蛋白結合率很低（23.9%～31.9%），提示烏頭堿在體內(nèi)能快速消除。所以，附子提取物經(jīng)吸收入血后在大鼠體內(nèi)殘留較少，毒性以急性毒性為主，并不會增加附子臨床長期給藥蓄積中毒的可能性。

2 附子有效成分藥動學研究

附子的主要成分是二萜生物堿，包括AC、MA、HA和毒性較小的BAC、BMA、BHA、烏頭原堿（aconine）、中烏頭原堿（mesaconine）和次烏頭原堿（hypaconine）。

在藥代動力學中，口服藥物的生物利用度是衡量藥物有效和安全的重要指標，而藥物在體內(nèi)的吸收與代謝的處置過程中，存在著由外排轉(zhuǎn)運蛋白和藥物代謝酶共同組成的一個相互偶聯(lián)、相互制約、互相平衡的“生物利用度屏障”。因此，深入了解外排轉(zhuǎn)運蛋白和藥物代謝酶對藥物的體內(nèi)處置作用及其機理，可以增加藥物的療效，減少藥物毒副反應。

2.1 附子有效成分的吸收機理研究 外排轉(zhuǎn)運蛋白，例如P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），多藥耐藥相關蛋白（Multidrug Resistance Protein 2，MRP2）和乳腺癌耐藥蛋白（Breast Cancer Resistance Protein，BCRP），作為機體的第一道防護屏障阻礙外來物對機體的入侵，把吸收進血液中的外來物外排至腸腔，從而保護機體，但也降低了藥物的生物利用度。

葉玲等[4]采用Caco-2、MDCKII、MDCKII-MDR1以及MDCKII-BCRP細胞模型研究了附子有效成分（AC、MA、HA、BAC、BMA、BHA、aconine和mesaconine）的體外吸收轉(zhuǎn)運情況。研究發(fā)現(xiàn)P-gp和BCRP參與了AC，MA和HA在細胞的吸收轉(zhuǎn)運，MRP2很有可能也參與了它們的吸收轉(zhuǎn)運；此外，MRP2有可能參與BAC、BMA和BHA的吸收轉(zhuǎn)運，而P-gp和BCRP并沒有參與它們的吸收轉(zhuǎn)運。目前沒有研究證明外排轉(zhuǎn)運蛋白參與aconine和mesaconine的吸收轉(zhuǎn)運。Yang等[5-6]也證實了無論是體外實驗，在體腸灌流實驗，還是體內(nèi)實驗，P-gp都參與了AC的吸收轉(zhuǎn)運，是烏頭堿口服生物利用度低的重要原因之一。利用大鼠外翻腸囊法和在體腸灌流技術，Zhang等[7]證明了AC、MA和HA在回腸的吸收最好，其次是空腸和十二指腸；P-gp介導AC、MA和HA的吸收轉(zhuǎn)運，然而MRP2卻并不影響這三者的吸收。Li Na等[8]更是用Caco-2細胞模型證實了AC、MA和HA不僅是P-gp的底物，而且是P-gp的抑制劑。

因此，大量研究證明了外排轉(zhuǎn)運蛋白介導附子有效成分的吸收轉(zhuǎn)運，其規(guī)律為生物堿的毒性越大，受到的外排作用越大，即AC、MA、HA＞BAC、BMA、BHA＞aconine、mesaconine、hypaconine。

2.2 附子有效成分的代謝機理研究

2.2.1 附子有效成分的體外代謝研究 肝臟含有大部分的代謝活性酶，而且具有很高的血流量，是藥物代謝最重要的器官。因此，藥物代謝不僅影響藥物作用的強弱和持續(xù)時間的長短，而且還會影響藥物治療的安全性，具有重要的現(xiàn)實意義。采用細胞色素P450酶（Cytochrome P450 enzymes，CYP450）技術進行體外代謝研究可以快速了解藥物的代謝方式、途徑，可為藥物毒性研究提供重要信息。

附子有效成分經(jīng)吸收進入機體后即與機體間發(fā)生一系列的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，在水解酶的作用下，毒性較大的雙酯烏頭生物堿能被代謝成毒性較小的單酯型生物堿和原堿型生物堿[9]。Wang等證實了烏頭堿在大鼠肝微粒體的作用下，通過脫甲基、脫乙基、脫氫、脫二甲基和脫乙?；绞疆a(chǎn)生6個代謝產(chǎn)物，參與代謝的主要CYP450亞型為CYP3A和CYP1A1／2[10]。然而，在人肝微粒體的催化下，烏頭堿主要在CYP3A4／5和CYP2D6的作用下產(chǎn)生6個代謝產(chǎn)物，代謝方式為羥基化、脫甲基、脫氫、脫乙基和脫二甲基[11]。由于AC和MA和HA具有相似的結構，研究表明MA和HA的代謝機理和AC相似。葉玲等[12]采用人肝微粒體，CYP化學抑制劑，單克隆抗體和人源化重組CYP450等方法證實了MA在人肝微粒體的作用下，至少生成9個代謝產(chǎn)物。主要的代謝途徑包括去甲基，脫氫，羥基化和脫氫去甲基。而HA則至少生成了11個代謝產(chǎn)物，代謝途徑為去甲基，脫氫，羥基化，脫氫去甲基和脫二甲基[13]。CYP3A4和CYP3A5在MA和HA的代謝中都發(fā)揮著至關重要的作用，其它CYP450亞型只發(fā)揮次要作用或不參與代謝。

AC和MA和HA在炮制過程中產(chǎn)生的一級水解產(chǎn)物BAC、BMA和BHA也有同樣的代謝方式。BAC、BMA和BHA在人肝微粒體的作用下，主要通過脫甲基、羥基化、脫氫去甲基和脫乙基等方式，分別產(chǎn)生7、8和9個代謝產(chǎn)物，主要受CYP3A4／5代謝酶的影響[14]。但是，AC和MA和HA的二級水解產(chǎn)物烏頭原堿、中烏頭原堿和次烏頭原堿卻幾乎不被肝臟代謝。文獻報道烏頭類生物堿的毒性歸因于C8位的乙酰基，C14位的苯甲?；?，C1、C6、C16和C18位的甲氧基，這些基團的解離可降低其毒性。從結構推斷，烏頭類生物堿的去甲基，脫氫去甲基代謝產(chǎn)物與原型相比，毒性可能降低。

綜上所述，附子主要有效／有毒成分在肝臟中主要被CYP3A4／5代謝，代謝率為AC、MA、HA＞BAC、BMA、BHA＞aconine、mesaconine、hypaconine，表明生物堿的毒性越大，越容易被機體代謝，降低毒性，再排出體外。

2.2.2 附子有效成分的體內(nèi)代謝研究 研究發(fā)現(xiàn)AC在大鼠體內(nèi)血藥濃度低，吸收極為迅速，并且代謝較快。大鼠經(jīng)口服給藥AC（0.2 mg／kg）后，其達峰濃度（Cmax）、達峰時間（Tmax）和消除半衰期（T1／2）分別為9.66 ng／mL、46 min和77.18 min[3，15]。此外，大鼠尾靜脈給藥AC、MA和HA（各0.6μg／kg）后，在大鼠體內(nèi)不僅檢測到了AC、MA和HA，還檢測到了BAC、BMA、BHA、aconine和mesaconine，表明高毒性的雙酯型生物堿在體內(nèi)可被代謝為毒性較低的單酯型生物堿和原堿型生物堿。而且AC，MA和HA在體內(nèi)的消除比他們的代謝產(chǎn)物BAC，BMA，BHA，aconine和mesaconine快得多（2.6～7.5倍），預示著毒性越大的烏頭類生物堿被機體消除的速率越快[9]。

Tazawa等人[16]也考察了大鼠尾靜脈給藥AC（0.02 mg／kg）后血漿中AC的藥動學特征，發(fā)現(xiàn)AC血藥濃度在1 h內(nèi)迅速下降，之后緩慢下降。同樣，大鼠灌胃給藥AC（0.1 mg／kg和1 mg／kg）都顯示AC消除迅速（Tmax＝45 min），且血藥濃度低。大量實驗表明烏頭類生物堿在大鼠體內(nèi)吸收極為迅速，并且代謝較快，生物利用度低[17]。

3 附子提取物及其有效成分對CYP450酶的影響

近年來，有關中藥與中藥之間，中藥與化學藥物之間基于代謝性相互作用的報道越來越多[18]。臨床上，附子一般與其他中藥配伍使用，以達到“減毒增效”的作用。研究表明，AC在人和大鼠體內(nèi)，其主要代謝途徑都是以水解代謝和脫甲基代謝、羥化代謝及脫氫代謝為主，這些代謝途徑主要由CYP3A介導[19]。通過體內(nèi)探針法，大鼠體外肝微粒體孵育法和Westernblot技術，結果表明無論是單次口服AC（0.125mg／kg）還是連續(xù)7 d口服AC（0.125mg／kg）后，AC對CYP3A的活性和蛋白表達均未產(chǎn)生顯著性影響，提示臨床上AC暴露不會增加基于代謝性的藥物相互作用發(fā)生的危險[20]。Yamada等[21]利用大鼠體外肝微粒體孵育法，對大鼠連續(xù)4 d口服給藥AC（0.002 mg／kg），AC并沒有顯著改變CYP3A的活性。畢云楓等[22]通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）的多反應監(jiān)測（MRM）技術，結合多探針底物方法，對單酯型及雙酯型烏頭類生物堿組分對細胞色素P450亞型的活性影響進行了研究，結果表明單酯型生物堿組分對CYP2C及CYP2D的抑制能力較強，雙酯型生物堿組分對CYP1A2，CYP3A，CYP2C和CYP2D有較弱的抑制作用。

此外，許多研究者開展了附子或烏頭提取物對CYP450的影響。石蘇英等[23]采用高效液相色譜、蛋白質(zhì)免疫印跡和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式技術，發(fā)現(xiàn)烏頭水提物能顯著降低CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1／2的活性，而對其蛋白表達無明顯影響。葛衛(wèi)紅等[24]研究證實，烏頭水提物能抑制CYP1A2和CYP2E1的活性，但誘導CYP3A4活性。來碩等[25]研究報道，0～0.5 mg／m L濃度范圍的附子水提物時對大鼠CYP3A具有誘導作用且呈現(xiàn)濃度依賴性，但在濃度0.50～1.00 mg／mL的范圍內(nèi)，其誘導作用開始減弱。

4 附子毒性研究

附子用之不當，易發(fā)生不良反應和中毒事件。因為附子中二萜生物堿尤其是雙酯型二萜生物堿有很強的毒性，主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性和心臟毒性[26]。在小鼠中，AC、MA和HA的半數(shù)致死量（LD50）分別為1.8、1.9和5.80 mg／kg[3，27]。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠中，AC5%致死量（LD5）和半數(shù)致死量（LD50）分別為0.2602和2.01 mg／kg，進一步驗證了烏頭堿的巨大毒性[28]。因此，臨床應用附子必須經(jīng)過炮制，炮制過程可使高毒性的雙酯型二萜類生物堿水解為低毒性（毒性低100倍以上）的單酯型二萜類生物堿和原堿型二萜類生物堿，從而達到減毒增效的作用。

5 小結

綜上所述，附子提取物及其有效／有毒成分的生物利用度屏障由藥物代謝酶和外排轉(zhuǎn)運蛋白組成，此屏障能減低附子的毒性，起到減毒的作用，但也是導致附子生物利用度低的重要原因之一。附子有效成分在體內(nèi)消除迅速，在體內(nèi)殘留少，它的不良反應大多由急性毒性造成，多劑量給藥并沒有增加附子的毒性，長期服用不會引起蓄積中毒。對附子及其有效／有毒成分進行藥代動力學研究，可為附子的臨床有效和安全用藥提供依據(jù)。

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（2014-01-06收稿 責任編輯：洪志強）

Progress of Pharmacokinetic Study on Fuzi

Xiaoshan Yang，Jinjun Wu，Linlin Lu，Lijun Zhu，Zhongqiu Liu
（International Institute for Translational Chinese Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

Fuzi，the processed lateral roots of Aconitum carmichaeli（Ranunculaceae family），is a widely used traditional Chinese medicinal herb due to their excellent pharmacological activities including anti-inflammation，analgesics，local anesthesia，and anti-tumor effect.Since there have been reports of adverse events，even toxic events of Fuzi，many pharmacokinetic studies were conducted to research Fuzi extract and its active ingredients.Present paper summarized progress of the researches.

Fuzi；Pharmacokinetic study

R285.5

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.010

973計劃項目“確有療效的有毒中藥科學應用關鍵問題的基礎研究項目”（編號：2009CB522800）

朱麗君，女，藥理學博士，廣州中醫(yī)藥大學國際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究所，廣東省廣州市番禺區(qū)廣州大學城外環(huán)東路232號，郵編：510006，

研究方向：中藥藥代動力學，E-mail：zhulijun115623＠163.com，電話：（020）39358404，傳真：（020）39358404