供肝體外灌注脫脂肪：擴大供體來源新途徑

王衛(wèi)利（譯）（天津市第一中心醫(yī)院移植監(jiān)護室，天津 300192）

大泡性脂肪肝大于30%可顯著增加肝細胞對缺血/再灌注（I/R）損傷的敏感性，是肝移植術后發(fā)生移植肝原發(fā)性無功能的重要危險因素。隨著肥胖、老年人群的增多，脂肪肝的發(fā)生率越來越高，從而影響供肝的來源及質量。一些研究表明，在植入前對供肝進行一些代謝干預可降低供肝的脂肪含量。這個設想已經在一些活體肝移植得到了成功驗證。但是，尸體供肝需要在體外對植入前肝臟進行處理。一些動物實驗已建立了體外對離體肝臟進行常溫灌注的模型。據此，我們推測通過體外灌注脫脂肪的過程可能增加供體的來源。本人將就目前關于脂肪肝加劇I/R損傷的機制，以及目前對于該問題的一些解決方案做一綜述。

1 供體池脂肪肝的流行病學

脂肪肝是非酒精性脂肪肝病的早中期改變，在北美，在體重指數大于正常范圍30%的肥胖人群，脂肪肝的發(fā)生率在65%以上［1-2］。形態(tài)學上，脂肪肝表現為脂滴在肝細胞內的聚積，根據肝細胞內脂滴大小，可分為小泡性和大泡性脂肪肝。小泡性脂肪肝肝細胞內的脂滴小，散在分布于胞質；一般認為，小泡性脂肪肝供體發(fā)生移植肝原發(fā)性無功能的風險較小，即使脂肪含量很高也可較安全地使用［3-6］。大泡性脂肪肝則表現為大脂滴位于肝細胞核周圍，甚至使細胞核發(fā)生移位；目前的研究表明，大泡性脂肪肝是移植術后移植肝原發(fā)性無功能的危險因素，并顯著增加術后病死率，增加術后腎功能衰竭等并發(fā)癥［3-6］。近期的一項大型研究表明，脂肪含量大于30%的脂肪肝可降低移植術后1年的生存率［5］，因此，多數移植中心一般放棄脂肪含量大于30%的供肝；但對于小于30%的脂肪肝則一般應用于移植［3-6］。但是當合并存在其他供體危險因素如老年、冷缺血時間長等，大泡性脂肪肝通常也會被放棄使用［5］。在過去的10年，美國肥胖發(fā)生率從9.8%上升至27.2%［7］，因此可以預測供體池中大泡性脂肪肝的比例會不斷增加。另一方面，人類整體壽命的延長，供體年齡的增加也進一步增加了供體的風險。因此，如果不對大泡性脂肪肝的使用采取相應的處理，我們可能面臨不遠的將來供體數量的急劇減少。

2 脂肪肝對I/R損傷的敏感性增加

在肝移植過程中，肝臟I/R損傷不可避免，但是研究表明，脂肪肝可顯著增加肝臟冷保存及后續(xù)的I/R損傷事件。體內及體外的一些動物實驗表明，肝臟I/R損傷大部分起始于肝實質細胞內［8-10］，且肝細胞內脂滴大量聚積可加劇肝細胞I/R損傷。有研究發(fā)現，小泡性脂肪肝細胞培養(yǎng)相對于非脂肪肝細胞，其對I/R損傷更加敏感，同時，肝細胞損傷后轉氨酶的釋放水平與肝細胞內的甘油三酯水平成正相關［9］。而在肝細胞內甘油三酯含量接近的小鼠模型，研究發(fā)現，大泡性脂肪肝比小泡性脂肪肝對I/R損傷更加敏感，因此表明，除了甘油三酯的含量，大脂滴本身也可加劇I/R損傷［8］。在人體肝臟，脂肪肝增加對I/R損傷的敏感性也已經被廣泛報導。

3 脂肪肝增加I/R損傷敏感性的機制

不論是臨床觀察還是動物實驗，目前的研究結果表明，脂肪肝增加I/R損傷的機制包括：① 更多的脂質過氧化反應；② 過度的炎癥反應，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的過度釋放，中性粒細胞的大量浸潤等［9，11-15］。這些研究并沒有區(qū)分大泡性還是小泡性脂肪肝。另外，有動物實驗發(fā)現，脂肪聚積的肝細胞體積增大，使肝竇變窄，影響肝細胞及肝竇微循環(huán)；進而影響肝細胞線粒體功能，降低肝細胞內 ATP 水平［8，9，12，15-16］。在Zucker大鼠的在體I/R損傷模型中，研究人員發(fā)現，脂肪肝臟的損傷主要表現為壞死，而非脂肪肝臟的損傷則主要表現為凋亡［17］，可能的解釋是，脂肪肝細胞內的ATP水平低下，而凋亡是一種需要ATP的細胞死亡。研究還發(fā)現，抑制凋亡可減輕非脂肪肝臟的I/R損傷，而對脂肪肝臟則沒有這種作用，進一步表明了脂肪肝相對于非脂肪肝在肝細胞損傷死亡機制上的不同［17］。

4 減輕脂肪肝I/R損傷的可能途徑

在動物實驗模型，一些不同的方法、技術被不斷嘗試用于減輕脂肪肝的I/R損傷，包括藥物預處理、缺血預處理的方法或是聯合藥物和缺血預處理。

4.1 藥物預處理

盡管有很多藥物被用來研究減輕肝移植過程的I/R損傷，但只有很少一部分是關于脂肪肝的研究［6］。一些研究將這些藥物加入冷保存液中，發(fā)現可以減輕脂肪肝大鼠的I/R損傷相關指標。如α受體、β受體阻斷劑卡維地洛可降低再灌注后轉氨酶水平、血管阻力、活性氧自由基水平，同時增加膽汁分泌量，增加肝內ATP水平［12］。另一項在肥胖Zucker大鼠I/R模型的研究發(fā)現，在再灌注前靜脈注射抗氧化劑谷胱甘肽酯可顯著降低脂質過氧化、I/R損傷標志物及肝細胞死亡水平［11］。在另一個類似的動物實驗，研究人員發(fā)現，在再灌注開始前24小時持續(xù)靜脈輸注他克莫司顯著降低了肝臟損傷水平，同時通過增加肝細胞內ATP水平使術后15天的生存率由40%升高到了70%。另一項研究在低溫I/R損傷的CMDD大鼠模型，該實驗通過給予無膽堿及無甲硫氨酸飲食誘導大鼠混合性脂肪肝，在肝臟的谷胱甘肽水平恢復正常前15分鐘給予谷胱甘肽前體N-乙酰半胱氨酸，可降低肝臟死亡標志物水平，減輕微循環(huán)損傷［15］；同時，該研究還發(fā)現，在熱缺血開始前60分鐘給予細胞黏附分子-1（ICAM-1）的抗體可抑制中性粒細胞浸潤，降低肝細胞死亡標志物水平［15］?？傊?，盡管上述研究結果均顯示了藥物預處理可顯著減輕肝細胞死亡標志物水平，但在多數的研究中，脂肪肝的損傷水平仍然高于非脂肪肝臟［11-12，18］。值得注意的是，上述研究中均為單種藥物預處理，或許聯合多種藥物進行預處理可顯著減低脂肪肝對I/R損傷的敏感性。

4.2 缺血預處理

缺血預處理是通過在缺血發(fā)生前給予短暫的缺血處理，目前的研究表明，不論是大泡性還是小泡性脂肪肝，缺血預處理可減輕再灌注后的脂質過氧化，改善肝臟微循環(huán)，減少中性粒細胞浸潤［8］。但是，缺血預處理對脂肪肝的保護作明顯低于其對非脂肪肝的保護作用，缺血預處理能使小泡性脂肪肝的肝細胞死亡標志物水平降低到非脂肪肝水平，但大泡性脂肪肝的肝細胞死亡標志物水平始終高于基線水平［8］。缺血預處理的保護作用機制可能與一氧化氮（NO）有關［8，11］。在患者行半肝切除手術時，缺血預處理也顯示了其對后續(xù)的I/R的保護作用。對輕中度脂肪肝亞組患者進行進一步分析，缺血預處理能降低肝臟損傷標志物的水平（血清丙氨酸轉氨酶 /天冬氨酸轉氨酶）［19］。

4.3 熱休克預處理

熱休克預處理也是一種可減輕I/R損傷的實驗方法。研究發(fā)現，在混合性脂肪肝的肥胖Zucker大鼠的I/R損傷模型，熱休克預處理可改善肝臟微循環(huán)參數，包括肝竇灌注率、肝竇直徑和白細胞內皮黏附［20］，防止微循環(huán)衰竭；該實驗還發(fā)現，熱休克預處理能降低氧化應激水平，減少肝臟損傷標志物水平［20］。類似的，在混合性脂肪肝的CMDD大鼠，熱休克預處理顯著提高了肝移植術后1周的生存率［21］；而且，研究發(fā)現，該熱休克保護作用的時間窗（熱休克處理后的6～24小時）正好與肝臟內的熱休克蛋白（HSP）表達相關，尤其是HSP72 及血紅素氧化酶 -1（HO-1）［20-21］。熱休克預處理的保護機制尚未闡明，關于熱休克預處理的具體實施方案，尤其是實施方案的合理性及可操作性，有待進一步研究。

5 體外脫脂肪：脂肪肝預處理的另一新選擇

上述預處理途徑主要通過降低大泡性脂肪肝I/R損傷相關事件，但是對于大泡性脂肪肝，嚴重的I/R損傷仍然不可避免，因此，通過在再灌注損傷發(fā)生前對脂肪肝進行脫脂肪處理可能是一種更加直接有效的方法。而且這種方法已經在人活體肝移植中得到了驗證，脂肪肝供體經過2～8周的控制飲食、聯合運動及藥物可使大泡性脂肪含量降低3倍［22-23］。該研究中，3位活體肝移植供者均通過活檢證實大泡性脂肪肝大于30%，他們通過1個月ω-3脂肪酸治療顯著降低了大泡性脂肪的含量［22-23］。上述研究中，同過“脫脂肪”均降低了大泡性脂肪含量并成功進行了肝臟移植［22-23］。應該指出，節(jié)食、運動可廣泛影響供體的代謝狀態(tài)，除了減輕脂肪肝，可能還存在其他非直接的因素影響供肝的質量。

動物實驗中常常通過飲食調整來調節(jié)肝臟的脂肪含量；在肝細胞培養(yǎng)的研究中，通過調整培養(yǎng)液的成分也可降低肝細胞的脂肪含量，這些“脫脂肪”的肝細胞對I/R損傷的敏感性也可恢復正常［9，24］。在CMDD誘導的大泡性脂肪肝大鼠實驗模型，在肝移植前對供體進行飲食控制至少3天來降低肝細胞內甘油三酯含量，可使肝移植受體的存活率從0%提高到75%［9］。另一項研究，對ob/ob小鼠給予48小時脂肪酸合成酶抑制劑治療，可使大泡性脂滴轉變?yōu)樾∨菪灾?，進而提高了I/R損傷后的生存率［24］；而且在肝臟獲取及移植前分別給予2天、4天或7天的脂肪酸合成酶抑制劑治療，移植后受體的存活率也隨治療時間的增加而相應地提高［24］。值得注意的是，脂肪酸合成酶抑制劑治療可增加肝臟ATP水平，并對內源性線粒體非偶聯蛋白2有降調節(jié)作用［24］?？傊鲜鲅芯勘砻?，通過“脫脂肪”，可逆轉大泡性脂肪肝對I/R損傷的敏感性。

6 體外機械灌注“脫脂肪”

上述研究都是有關活體肝移植，通過對脂肪肝供體進行若干天的治療干預，其“脫脂肪”策略是有效的；但是在尸體肝移植，“脫脂肪”的時間必須加速至若干小時，這樣才能與目前肝臟獲取至移植的時間窗相吻合，一般在12小時以內［25-26］。盡管在器官獲取前對尸體供體進行“脫脂肪”治療在理論上也可行，但是通過對獲取的供肝進行機械灌注，對于灌注的藥物種類及劑量將會更加靈活［27］。目前，有研究通過對Zucker大鼠脂肪肝進行幾小時的體外灌注來“脫脂肪”，研究結果令人鼓舞［28］。

機械灌注不但能給予“脫脂肪”制劑提供一個很好的輸注平臺，相對于傳統(tǒng)靜態(tài)的冷保存，其本身就能改善肝臟的活力，這些已經在包括非脂肪肝、缺血肝臟及大泡性脂肪肝的機械灌注研究中得到了證實［13，27，29］。研究發(fā)現，對從 CMDD 大鼠獲取的大泡性脂肪肝進行1小時的體外常溫灌注，相對于靜態(tài)的冷保存，其肝臟死亡標志物水平下降，膽汁分泌量、氨清除率、尿素產生及ATP水平則顯著增加［30］。目前尚未對人的肝臟常溫機械灌注進行研究，但在哥倫比亞大學近期完成的一項1期臨床試驗結果發(fā)現，相對于靜態(tài)冷保存，體外低溫機械灌注7小時可減少術后早期移植物功能障礙、膽道并發(fā)癥、血管并發(fā)癥的發(fā)生，縮短住院時間［25］。后續(xù)的研究顯示機械灌注可降低前炎癥因子水平，增加受體肝臟ATP水平［26］。但是，目前尚無針對人類大泡性脂肪肝進行機械灌注的研究。

目前已有3項關于大泡性脂肪肝體外機械灌注“脫脂肪”的動物實驗研究［13，28，31］。Jamieson 等［31］對豬肝進行體外48小時的常溫機械灌注，發(fā)現肝臟內的脂滴含量降低了50%，接近非脂肪肝的對照組水平。通過60小時的體外脫脂肪，脂肪肝組的一些肝功能指標如膽汁分泌量，尿素生成量及白蛋白水平與非脂肪肝臟對照組相仿［31］。另一項研究中，采用類似的體外灌注技術對肥胖Zucker大鼠肝臟進行6小時不同溫度（4、8、20 ℃）的體外機械灌注，研究結果顯示，相對于冷保存，機械灌注顯著降低了肝細胞死亡標志物水平，改善了肝臟功能［13］；而且20 ℃的機械灌注相對于4 ℃和8 ℃更好的保存了肝臟功能［13］；組織學研究也發(fā)現，20 ℃的體外灌注可降低脂肪肝細胞的脂滴含量，而4 ℃和8 ℃的機械灌注則無上述“脫脂肪”效果［13］。

另一動物實驗研究旨在探討加速體外灌注過程［28］，希望能把體外灌注的時間與目前臨床肝臟保存時間相一致。該研究首先通過對肝細胞培養(yǎng)液加入不同的藥物，篩選出潛在的脫脂肪藥物，然后將篩選出的藥物混合配置成“雞尾酒”，再對Zucker肥胖大鼠肝臟給予“雞尾酒”體外常溫灌注，灌注3小時，肝細胞內的甘油三酯含量降低50%，大泡性脂滴減少，并轉為小泡性脂滴。這種脫脂肪速度顯著快于肝細胞培養(yǎng)液的脫脂肪速度，一般在肝細胞培養(yǎng)液中，該過程需要幾天的時間。這種脫脂肪速度的顯著不同，可能的解釋是肝細胞培養(yǎng)液不含肝細胞以外的間質細胞，但是目前對于間質細胞在脫脂肪中的作用尚不明確［9，10］；另一可能的解釋是相對于靜態(tài)的細胞培養(yǎng)，器官灌注能提供肝細胞足夠的營養(yǎng)及其他因子，同時有效清除代謝廢物的排出，進而加快脫脂肪速度［28］。

7 加強脫脂肪的策略

7.1 常溫體外灌注

盡管體外常溫灌注在動物實驗研究中取得了成功，但將其用于臨床脂肪肝體外脫脂肪仍需要克服若干障礙。盡管機械灌注的概念已被臨床接受，但目前所有的灌注系統(tǒng)均為低溫灌注，并不是常溫灌注［25，32］。因為脂質氧化及轉運的過程可能在低溫狀態(tài)下會顯著減慢，低溫狀態(tài)可能不利于脫脂肪，盡管該問題尚未得到實驗證實［29，33］。另一方面，超生理狀態(tài)的灌注溫度可能也是一個研究課題，因為高溫有可能觸發(fā)熱休克預處理，進而保護器官的I/R損傷［21］。然而，一旦有足夠多的證據支持體外低溫灌注臨床應用的可行性，臨床研究人員可能會傾向于向體外常溫灌注研究領域邁進。

常溫體外灌注系統(tǒng)要求進一步研制可轉運的灌注設備，以適應臨床上陸地及航空轉運的需要。同時，常溫灌注系統(tǒng)需要更高的閾值，因為一旦出現機器故障，無論是識別異常還是工作異常，血流停止會引起快速的熱缺血損傷；相反，在低溫灌注系統(tǒng)，一旦出現上述問題，血流停止也僅僅是相當于目前臨床常規(guī)應用的冷保存，其對器官的損傷遠小于熱缺血損傷［25-27］。

但是，常溫灌注帶來的益處可能遠遠大于上述顧慮可能產生的不利。常溫灌注狀態(tài)下，肝臟處于代謝活性狀態(tài)，這樣有利于對肝臟功能的全面評估，進而利于肝臟移植，這是單純的冷保存或低溫機械灌注所不能比擬的。體外常溫機械灌注這種創(chuàng)新的復蘇干預所帶來的益處可能會使研究人員不斷發(fā)展完善這種技術，并向臨床應用推進［27］。

7.2 優(yōu)化灌注液

肝臟脫脂肪的最終目標是快速降低含大泡性脂滴的肝細胞比例，進而維持肝臟的高活性和高功能。脂肪肝的發(fā)生是肝細胞甘油三酯合成及分解過程不平衡的結果［1，2，9，28］。所以，脫脂肪的過程應該使這種不平衡向著增加甘油三酯分解及相關代謝產物排出，減少甘油三酯合成的的方向轉移［9，28，31，34］。雖然脂肪代謝的過程已經十分明確，但是應用藥物來調節(jié)脂質代謝過程以獲得快速脫脂肪，而不影響肝臟活力及功能，仍有大量的工作要做。

已有大量的文獻報道關于肝臟脂質代謝的轉錄因子，但是轉錄調節(jié)一般需要的反應時間至少6小時，因此針對轉錄途徑的復合物并不能在體外灌注的時間窗內起作用。通過轉錄后途徑作用的藥物，包括信號效應分子，代謝底物及共作用因子，可考慮用于體外灌注。下面簡要介紹脂肪合成、分解的過程。脂肪分解需要Perilipins與脂肪酶作用，Perilipins是位于甘油三酯脂滴表面的蛋白，脂肪酶則分解甘油三酯為二酰甘油、單酰甘油、游離脂肪酸及甘油［28，34-36］。Forskolin可間接激活蛋白激酶A（PKA），增加脂滴表面的Perilipin5的磷酸化，加速脂肪分解過程［28，36，37］。脂肪分解產物如不及時代謝和（或）被分泌至肝細胞外，可重新合成脂肪。脂肪分解產物可通過酯化反應重新合成甘油三酯，與VLDL結合成脂蛋白顆粒進而分泌到肝細胞外［34］。脂蛋白B及磷脂是極低密度脂蛋白（VLDL）的重要組成成分，添加氨基酸及膽堿被證實能分別促進脂蛋白B及磷脂的合成，進而降低脂肪合成［28，38］。另一加速脫脂肪的途徑是增加游離脂肪酸向線粒體轉運，加快脂肪酸的β氧化［28，39］。游離脂肪酸從胞質向線粒體轉運是β氧化的限速步驟，該步驟需要位于線粒體外膜的肉堿軟脂酰轉移酶（CPT-1）將乙酰輔酶A與L-肉堿結合并轉運。體內、體外的研究均顯示，膳食補充L-肉堿或向細胞培養(yǎng)基中加入L-肉堿可加速脂肪酸的β氧化，降低肝臟甘油三酯含量［40］。因此，通過同時多個途徑聯合作用可能產生更有效的脫脂肪效應，但是這種聯合脫脂肪方案的合理設計需要對大泡性脂肪肝細胞相關代謝途徑之間的潛在相互作用有更加深入的理解。建立適宜的大泡性脂滴肝細胞培養(yǎng)系統(tǒng)將十分利于上述問題的研究，但是目前文獻僅有一些小泡性脂滴肝細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的描述，尚未見有大泡性脂滴肝細胞培養(yǎng)報道［9，28］。

最終，外科醫(yī)師需要大量的證據來證實，通過脫脂肪的肝臟確實與正常的非脂肪肝臟十分相似，體外脫脂肪才能在臨床被真正廣泛認可。因此對脂肪肝通過體外短時間的常溫機械灌注進行快速脫脂肪后的短期和長期功能評估將是至關重要的。雖然目前仍有大量的問題需要解決，但肝臟體外脫脂肪仍被認為具有巨大的應用前景，將可能使目前大量被丟棄的脂肪肝應用于肝臟移植。