抗HIV-1基因治療新進展

田雅茹 焦艷梅 張 彤 吳 昊

(首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染中心，北京100069)

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是人類感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)后導致免疫缺陷，并發(fā)一系列機會性感染及腫瘤，嚴重者可導致死亡的綜合征。該病傳播速度快、病死率高，是危害極大的傳染性疾病之一。HIV主要有2種類型:HIV-1和HIV-2，其中HIV-1是引起艾滋病的主要病原。因此，目前艾滋病的防治研究主要是針對HIV-1進行的。自從20世紀90年代后高效抗反轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)應用于艾滋病的臨床，使HIV-1患者的病毒載量下降及CD4+T細胞水平升高［1］，降低了HIV的發(fā)病率和病死率，顯著地改變了HIV-1感染者發(fā)展到AIDS的進程，但是HAART需要堅持終身用藥，這會引發(fā)藥物不良反應、病毒耐藥突變和經(jīng)濟負擔等問題［2］。長期藥物治療會出現(xiàn)一些合并癥，包括心血管疾病、肝衰竭以及HIV相關神經(jīng)認知功能障礙［3-5］，而且即使在HAART治療的前提下，一些患者體內(nèi)仍然存在持續(xù)低濃度的病毒血癥［6］。鑒于HAART的這些局限性及人們對抑制HIV-1感染機制理解的增加，研究者們開始致力于抗HIV-1的基因治療，即將人工合成的外源基因通過基因轉移技術導入靶細胞中，以外源基因的表達產(chǎn)物使靶細胞抵抗HIV-1的感染。基因療法無論是作為獨立的治療方法，還是作為藥物的輔助方案，都顯示良好的發(fā)展前景。本文主要對近5年來該領域中的一些治療策略的新進展進行綜述，包括:①基于RNA的抑制劑，如反義RNA、RNA干擾、核酶、RNA誘餌和RNA適體;②基于蛋白的抑制劑，如顯性陰性突變體蛋白、細胞內(nèi)抗體、細胞內(nèi)趨化因子、融合抑制劑和鋅指核酶。同時探討了基因治療的應用策略及目前轉基因方法的發(fā)展情況。

1 基于RNA的抑制劑

1.1 反義RNA

反義RNA(antisense RNA)是指與mRNA或DNA互補的小單鏈RNA分子，通過堿基配對形成mRNA/RNA或DNA/RNA的雜交雙鏈，從而抑制基因表達并加速其降解。天然的反義RNA廣泛存在于各類生物中，是細胞基因表達調(diào)控的一種方式。近幾年來很多研究［7-8］通過人工合成的反義 RNA靶向HIV-1蛋白及靶細胞受體等的基因，與靶基因配對形成無功能的雙鏈從而封閉或調(diào)節(jié)靶基因功能及產(chǎn)物表達，有效地阻斷HIV在細胞中的復制。

Levine等［7］構建了一種條件復制型慢病毒載體，表達靶向HIV-1包膜蛋白RNA的長的反義RNA，并用這個載體轉染自體CD4+T細胞后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。Tebas等［8］在對后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)這些患者在停止抗反轉錄病毒治療后，其病毒載量下降，有一個患者測不出HIV-1 RNA的時間長達104 d。目前這些反轉錄產(chǎn)物抑制HIV-1復制的實際機制還不明確，可能涉及促使HIV反義雙鏈的大量腺苷脫氨基，從而導致細胞核轉錄停滯或者產(chǎn)生大量病毒無效突變。

1.2 RNA干擾

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指小雙鏈RNA在細胞內(nèi)特異性地誘導與之同源互補的mRNA降解，抑制相應基因的表達，從而引起轉錄后基因沉默的現(xiàn)象［9］。目前研究的有微小 RNA(microRNA，miRNA)、小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)、短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA，shRNA)均能夠介導RNA干擾作用。miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的單鏈非編碼小分子RNA，通過與細胞內(nèi)靶mRNA 3'端-UTR區(qū)不完全互補配對或與靶mRNA完全互補配對來發(fā)揮抑制mRNA翻譯或降解靶mRNA的作用。Nathans等［10］研究表明 miR-29a能直接靶向HIV-1 nef基因，從而降低細胞內(nèi)的病毒水平，而miR-198可抑制反式轉錄激活因子(transactivator of transcription，Tat)的輔助因子Cyclin T1，限制HIV-1對單核細胞的感染［11］。這些研究［9-11］均表明細胞內(nèi)的天然miRNA對HIV-1的感染具有抑制作用，這也激起了很多研究者通過人工構建miRNA以發(fā)揮對HIV-1更強的抑制作用的興趣。Liu等［12］構建的mir-17－92可使HIV-1的復制受到有效的抑制。Aagaard等［13］構建的三聯(lián)mir106b簇人工miRNA經(jīng)實驗證明對HIV-1復制表現(xiàn)出更強的抑制作用。

siRNA是由外源性雙鏈RNA(如病毒感染或人工插入)被細胞內(nèi)Dicer酶切割而成的具有21～22個堿基對的小雙鏈RNA分子。研究［14］表明，siRNA在抗病毒治療方面非常有效，而且已研發(fā)了一些RNA干擾的治療策略，來治療遺傳性疾病或傳染性病原體。因為人們對HIV-1的生命周期和基因表達模式理解的比較多，所以HIV-1成為第1個被RNAi靶向的傳染性病毒。在RNAi治療中，由于能夠產(chǎn)生特異抵抗的病毒株，因此選擇合適的靶點很重要，目前已經(jīng)通過實驗證明比較有效的靶點包括HIV基因組的病毒顆粒蛋白表達調(diào)節(jié)因子(regulator of expression of virion proteins，Rev)、tat等基因［15］和宿主的核轉錄因子κB［16］(nuclear transcription factor κB，NF-κB)、CD4 受體、CC趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR5)和CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)等，抑制這些分子的表達可以有效地抑制病毒復制和感染過程。但是，最近有研究［17］發(fā)現(xiàn)，HIV存在一種交叉抵抗機制，即當對某一種siRNA產(chǎn)生突變逃逸的同時，可以對另一種針對不同靶點的siRNA產(chǎn)生逃逸，目前具體機制仍然不清楚。這一發(fā)現(xiàn)為RNAi抗HIV治療靶點的選擇提出了更高的要求。鑒于宿主細胞基因產(chǎn)物在抗HIV RNAi治療中不易產(chǎn)生突變逃逸的優(yōu)點，目前，抗HIV新靶點的開發(fā)主要集中在與病毒復制相關的人類基因上。有些靶點已經(jīng)被用于實驗性抗HIV治療，并取得了比較好的效果［18-19］。目前解決HIV-1突變逃逸的最好的方法是同時使用多個針對不同靶點的RNA干擾抑制劑［20］。Liu等［12］利用 mir-17 －92 多順反子的骨架結構同時表達4個針對HIV-1不同位點的siRNA，使HIV-1的復制受到了有效的抑制。Ehsani等［21］依據(jù)miRNA作用于mRNA的3'端UTR區(qū)可以抑制靶基因翻譯的原理，將HIV-1 3'端UTR的部分互補序列插入到針對gag-pol基因和HIV-1的輔助受體CCR5基因的siRNA序列中，結果這種具有雙重功能的siRNA同時在轉錄和翻譯水平抑制了基因的表達，并可避免病毒逃逸的產(chǎn)生。

為了防止RNA酶對siRNAs的降解，通常將siRNAs做成發(fā)夾狀，即shRNAs，再用慢病毒載體等導入細胞內(nèi)。已經(jīng)有研究組［22］構建了能穩(wěn)定下調(diào)CCR5表達的shRNAs，他們在體外實驗中發(fā)現(xiàn)慢病毒載體投遞針對CCR5的shRNAs能有效地降低細胞CCR5的表達，并賦予細胞對CCR5嗜性毒株的抗性。研究者［23］先前已經(jīng)證明即使應用單一的shRNAs也會顯著的抑制HIV-1，但是也觀察到HIV-1在RNA干擾的壓力下，通過其靶序列的突變而迅速逃逸。為了避免這個問題，針對HIV不同位點的多個有效的shRNAs組成的聯(lián)合體就可以長期抑制HIV-1的復制，這種抗HIV-1的RNA干擾組合的基因療法將進入臨床試驗［24］。有研究［25］顯示shRNAs的表達是決定其毒性的關鍵因素。Kiem等［25］利用RNA聚合酶III啟動子U6區(qū)過表達shRNAs可導致原始T淋巴細胞的細胞毒性，為了避免shRNAs細胞毒性，可以利用轉錄活性較弱的RNA聚合酶III的H1啟動子來降低shRNAs的表達，同時選擇一種強有力的靶向CCR5的shRNAs以保證能有效地下調(diào)CCR5的表達。這種優(yōu)化的組合方法使體外人原始T淋巴細胞和源自CD34+細胞的巨噬細胞的CCR5受體降低了25倍，并且沒有毒性作用［26］。

目前RNA干擾在基因治療方面仍然有許多問題需要解決。由于機體固有免疫反應的激活和與內(nèi)源性RNA的功能競爭，基于RNA的方法有潛在的脫靶毒性［27］及非特異性的免疫應答，如果長期應用可能干擾內(nèi)源miRNA的功能［28］。

1.3 核酶

核酶是能酶促切割靶mRNA的反義RNA。按分子大小可分為大分子核酶和小分子核酶，大分子核酶由幾百個核苷酸組成，結構復雜。小分子核酶僅含幾十個核苷酸，其中包括錘頭狀核酶、發(fā)夾狀核酶、丁型肝炎病毒核酶以及鏈孢霉線粒體合成酶與核酶復合體［29］。目前已有很多研究證明以核酶為基礎的用于治療HIV感染的相關策略。使用一種丁型肝炎病毒來源的核酶靶向HIV-1的tat和rev序列，體外觀測到靶mRNA被裂解，能使tat介導的反式激活水平降低62% ～86%［30］。提高核酶抗HIV-1效果的關鍵也是選擇合適的靶點，Mitsuyasu等［31］設計了針對vpr和tat基因重疊區(qū)的核酶 OZI，該核酶可以有效抑制HIV-1的復制，同時在長期的細胞培養(yǎng)中核酶靶基因區(qū)的耐藥位點并沒有發(fā)生突變。此外，將核酶與靶RNA進行共定位也可以達到理想的抗HIV-1效果。Unwalla等［32］將核仁小 RNA(small nucleolus RNA，snoRNA)U16區(qū)中1～2個莖環(huán)隨機插入錘頭狀核酶中，建立了一個錘頭狀核酶基因庫，通過與含有HSVTK基因的前病毒DNA共轉染HEK293細胞，最終篩選出一個與U5區(qū)和gag基因部分同源的核酶序列，該核酶可以與靶RNA共定位于細胞核，從而有效地抑制HIV-1復制。為了防止發(fā)生HIV-1病毒的突變逃逸，可設計針對HIV-1基因的多個靶點的核酶。研究者［33］針對人CCR5 mRNA的7個靶位點設計了多位點錘頭狀核酶Rz1－7，與單一錘頭狀核酶相比，該核酶對CCR5 mRNA表達水平的下調(diào)更為持久有效，幾乎完全阻止了HIV-1對細胞的感染。DiGiusto等［34］用慢病毒載體將核酶導入由HIV-1感染者體內(nèi)分離的自體CD34+細胞，然后將這些細胞再回輸?shù)交颊?不管有沒有進行骨髓預處理)體內(nèi)去治療艾滋病相關淋巴瘤，證明了用慢病毒－核酶載體進行基因改造細胞是安全的。

1.4 RNA誘餌

RNA誘餌作為一種外源性RNA，其序列與病毒復制過程中重要調(diào)節(jié)蛋白結合的順式作用元件相似，通過競爭性地結合調(diào)節(jié)蛋白而起到抑制病毒復制的作用。以人免疫缺陷病毒tat蛋白的反式激活應答(transactivating response，TAR)元件為基礎設計的TAR誘餌也可用于基因治療。研究者［34］將TAR誘餌與針對HIV-1 tat/rev的短發(fā)夾RNA及靶向CCR5的核酶共表達于一個慢病毒載體(rockville，MD)，這種三重組合的載體已經(jīng)獲得美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準用于艾滋病或淋巴瘤患者自體外周血干細胞移植的臨床試驗。最近已經(jīng)進行了I期臨床試驗測試了這種載體，可以顯著抑制HIV-1的復制。

1.5 RNA適體

RNA適體是指體外篩選得到的能高親和力地結合目標配體的單鏈寡聚核苷酸。盡管適體在抗HIV中展示出前景，但到目前為止，還沒有應用抗HIV適體的臨床試驗，可能因為體外篩選的適體在細胞內(nèi)也許不形成所需的三級結構來有效地結合靶蛋白。近年主要研究的是利用適體介導siRNA的細胞特異性傳遞［35］。

2 基于蛋白的抑制劑

多數(shù)的蛋白抑制劑是從病毒載體長末端重復序列中表達，但在一些情況下，它們是由插入病毒載體中的強大的啟動子產(chǎn)生。

2.1 顯性陰性突變體

顯性陰性突變體是病毒蛋白的重要功能區(qū)出現(xiàn)突變。這種突變體蛋白可以和野生型病毒蛋白競爭結合靶位點，或與其形成多聚體，從而抑制正常病毒蛋白的功能。第1個用于抗HIV-1基因療法臨床試驗的蛋白是艾滋病病毒Rev蛋白的突變體M10(Rev M10)。Rev M10蛋白通過阻斷單個剪接和未剪接的艾滋病病毒RNA從細胞核到細胞質(zhì)的輸出，來阻止病毒顆粒的組裝及隨后的播散。目前這種突變蛋白仍然是一種最有效的抑制HIV復制的抑制劑。

2.2 細胞內(nèi)抗體、細胞內(nèi)趨化因子

細胞內(nèi)抗體和細胞內(nèi)趨化因子也是非常有效的HIV復制抑制劑。這些蛋白與病毒或細胞的靶蛋白結合，導致靶蛋白被蛋白酶降解。值得注意的是，這些靶蛋白包括HIV-1輔助受體CXCR4［36］。

2.3 融合抑制劑

融合抑制劑能夠在細胞表面與HIV-1的gp41結合而阻止病毒進入細胞。這些阻斷HIV進入細胞的蛋白可從反轉錄病毒或慢病毒載體鏈中表達，因而適合在基因治療中應用。恩夫韋肽(FUZEON，羅氏)，俗稱T20，通過抑制病毒包膜與細胞膜融合所需的構象改變來阻斷HIV進入細胞，已于2003年被美國FDA批準用于臨床實踐［37］。但是為了克服對T20已經(jīng)產(chǎn)生的耐藥性以及改進T20的一些不足，如體內(nèi)生物利用度低、使用不便(皮下注射，2次/d)、價格昂貴等因素，需要研發(fā)新的融合抑制。最近研究了1種新的融合抑制劑，稱為C46，是由來自gp41的第2個七肽重復區(qū)的氨基酸組成，類似于T20，C46通過與HIV-1 gp41融合中間體的N末端卷曲螺旋核結合，阻止六螺旋體核心結構的形成，從而阻止HIV-1與細胞的融合。與其他基于蛋白的抑制劑一樣，也能由反轉錄病毒載體表達并用于基因治療［38］。最近的一份報告［39］證實，與 tat/rev特異的shRNAs和靶向HIV膜蛋白基因的長反義RNA(稱為VRX496)相比，C46的抑制HIV-1感染的效果更強。C46的一種膜錨定形式(maC46)能賦予非人類靈長動物造血干細胞對HIV的抵抗性。值得注意的是，在體外及人源化小鼠體內(nèi)接種HIV-1后，證明maC46賦予轉導細胞選擇性優(yōu)勢的能力最強。西夫韋肽(sifuvirtide)是我國自主研發(fā)的第3代HIV-1融合抑制劑，研究［40］結果顯示，其具有顯著的抗病毒效果，且對T20耐藥毒株有很好的抑制效果，目前，該化合物已完成臨床Ⅱb期研究。

2.4 鋅指核酸酶

鋅指核酸酶是一種人工設計、表達的融合蛋白，包含2個結構域:DNA結合鋅指蛋白結構域和核酸內(nèi)切酶結構域［41］，能專一性地結合特定基因組序列，然后其中的核酸酶內(nèi)切割靶DNA。當這些雙鏈切口修復的時候，就會在分裂部位發(fā)生高頻缺失和插入。通過鋅指核酸酶破壞CCR5基因的編碼序列，會產(chǎn)生無功能的CCR5突變體，致使細胞對HIV的CCR5嗜性毒株具有抵抗性。在臨床前研究中，Perez等［42］報道了用腺病毒載體投遞針對CCR5氨基末端的基因編碼序列的鋅指核酸酶，導致人CD4+T細胞的CCR5等位基因破壞了50%。Holt等［43］將CCR5基因特異的鋅指核酸酶導入由人臍帶血和胎肝分離的CD34+細胞，結果CD34+細胞的CCR5等位基因破壞率大約為17%，他們估計有5%～7%的鋅指核酸酶處理的細胞可能在2個等位基因上發(fā)生了突變。目前所面臨的難題是，只能將鋅指核酸酶蛋白或基因轉錄單位短暫地轉導入細胞中，因為鋅指核酸酶穩(wěn)定表達可能引起基因毒性(來自染色體破壞，如易位)，而目標是在引起單一突變后，就從細胞中清除核酸酶。

總之，雖然基于蛋白的方法在體外有強大的抗病毒效應，但是不僅需要維持其足夠的表達水平，而且要避免在體內(nèi)的免疫原性，因為誘發(fā)的免疫反應會使其抗病毒活性喪失。因此，蛋白抑制劑進入臨床試驗中后，需要評估其效能和免疫原性。

3 目前基因療法的應用策略

3.1 針對靶細胞受體

HIV-1與靶細胞的CD4受體及輔助受體CXCR4、CCR5結合是其感染細胞的早期步驟，因此通過上述基因療法使這些受體的表達減少來抑制HIV-1的感染是近年來的研究方向。但是由于遺傳研究［42-43］表明CD4的破壞會導致嚴重的免疫缺陷，而CXCR4受體是造血干細胞歸巢和T細胞分化必不可少的受體，所以靶向這些受體可能不是一個可行的方法。相反，CCR5受體的破壞不影響免疫功能，具有CCR5受體32bp缺失的純合子突變體的人更耐受HIV的CCR5嗜性毒株，所以CCR5輔助受體作為靶向目標，通過破壞CCR5來實現(xiàn)免疫系統(tǒng)抵抗HIV病毒的目的，這一方法將特別有前景，目前已經(jīng)有很關于這方面的研究［21-22，26，42-43］。

3.2 聯(lián)合策略

單一的抗HIV-1基因治療可能導致病毒突變逃逸的發(fā)生，而且應用CCR5抑制劑治療的病例可能出現(xiàn)CXCR4嗜性和雙嗜性HIV-1毒株，因此聯(lián)合多個抗HIV-1基因治療的策略來抑制病毒生命周期的多個步驟以保護靶細胞是非常重要的［12，20-21，24，33］。通過這種方法，有研究組［44］已將多個抗HIV基因并入到一個單一的慢病毒載體。有研究［45］表明將針對CCR5的shRNAs、人類/恒河猴的嵌合TRIM5α(tripartite motif protein 5-alpha)和TAR誘餌共表達于一個慢病毒載體，這種抗病毒的三重組合在體外有效地抑制了來自CD34+細胞的巨噬細胞的HIV-1復制。這樣的做法還有，將一種膜錨定的融合抑制劑C46和多個針對tat/rev的shRNAs被聯(lián)合表達在一個慢病毒載體上［25］。盡管這些研究非常有前景，預計未來將會研發(fā)出更新的抗HIV-1基因制劑及更有效的組合方法。

4 抗HIV-1基因治療中的基因轉運方法

目前在抗HIV-1基因治療研究中的基因投遞方法很多，如病毒載體中的反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體等，非病毒載體中的免疫脂質(zhì)體和穿透肽介導的抗體靶向傳遞方法［46-47］。隨著納米技術的發(fā)展，出現(xiàn)了更多的材料和方法，如利用明膠、殼聚糖等多聚物以及樹狀大分子、納米粒子等非多聚物進行藥物輸送［48］。本文著重探討近年來研究較多的慢病毒載體和抗體靶向傳遞。

4.1 慢病毒載體

由于慢病毒載體可以感染非分裂期的細胞，能夠高效的整合到細胞的基因組中，并穩(wěn)定傳遞到子細胞中長期表達，所以應用很廣，而且已經(jīng)有研究［49］證明第3代慢病毒載體用于人類是安全的，到目前為止還沒有報道插入性腫瘤的發(fā)生。但是在HIV-1靶細胞—巨噬細胞和樹突細胞中由于存在髓系來源的抗HIV-1 限制因子 SAMHD1［50-54］(sterile α motif domain and HD domain-containing protein 1)，所以對于慢病毒載體的轉染不敏感。但猴免疾缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)及HIV-2來源的Vpx蛋白能夠誘導SAMHD1降解來解除其抑制作用，據(jù)此原理，Bobadilla等［51］將一段 SIVmac/HIV-2來源的 Vpx序列引入慢病毒載體，顯著提高了慢病毒載體對巨噬細胞和樹突細胞的感染能力。

4.2 抗體介導的靶向傳遞

抗體通過與抗原結合后內(nèi)化將siRNA靶向投遞至靶細胞中。實驗中常用的抗體包括抗CD7和淋巴細胞功能抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1)抗體等。但是能夠介導內(nèi)化的抗體并不容易制備，目前研究者常用穿透肽或免疫脂質(zhì)體與抗體相連后介導抗體內(nèi)化，并用于RNAi治療中，取得不錯的結果。Kumar等［52］將CD7單鏈抗體與穿透肽形成能夠內(nèi)化的融合抗體，然后連接針對HIV-1 vif、tat基因以及針對宿主細胞CCR5基因的siRNA并注入人源化HIV-1病毒血癥的小鼠體內(nèi)，結果有效地抑制了HIV-1的復制并且增加了CD4+T細胞數(shù)量。Kim等［53］將靶向LFA-1的免疫脂質(zhì)體包裹CCR5 siRNA成為納米顆粒，注射病毒血癥的人源化小鼠能夠有效地抑制病毒的擴增以及感染造成的CD4+T細胞減少。

5 結語

抗HIV-1的基因療法有許多可選方案，轉基因可以編碼以RNA為基礎的制劑，也可以編碼以蛋白為基礎的制劑。該領域面臨的主要問題是抗HIV基因的靶向專一性、防止病毒抵抗性和這些制劑的潛在抗原性。鑒于在高效抗反轉錄病毒治療中聯(lián)合應用藥物所取得的成功，最有意義的做法是，設計出抗病毒基因聯(lián)合體共同表達于細胞的基因治療策略。相對于僅僅靶向細胞或病毒基因，靶向CCR5和病毒基因的聯(lián)合體有理論上的優(yōu)勢。鑒于現(xiàn)有的抗病毒基因的所有組成部分，這應該是未來基因治療試驗的目標。

［1］Kitahata M M，Gange S J，Abraham A G，et al.Effect of early versus deferred antiretroviral therapy for HIV on survival［J］.N Engl J Med，2009，360(18):1815-1826.

［2］Richman D D，Margolis D M，Delaney M，et al.The challenge of finding a cure for HIV Infection［J］.Science，2009，323(5919):1304-1307.

［3］Lekakis J，Ikonomidis I.Cardiovascular complications of AIDS［J］.Curr Opin Crit Care，2010，16(5):408-412.

［4］Nunez M.Clinical syndromes and consequences of antiretroviral-related hepatotoxicity［J］.Hepatology，2010，52(3):1143-1155.

［5］Xia C，Luo D，Yu X，et al.HIV-associated dementia in the era of highly active antiretroviral therapy(HAART)［J］.Microbes Infect，2011，13(5):419-425.

［6］Dinoso J B，Kim S Y，Wiegand A M，et al.Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in pa-tients on highly active antiretroviral therapy［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(23):9403-9408.

［7］Levine B L，Humeau L M，Boyer J，et al.Gene transfer in humans using a conditionally replicating lentiviral vector［J］.Proc Natl Acad Sci，2006，103(46):17372-17377.

［8］Tebas P，Stein D，Binder-Scholl G，et al.Antiviral effects of autologous CD4 T cells genetically modified with a conditionally replicating lentiviral vector expressing long antisense to HIV［J］.Blood，2013，121(9):1524-1533.

［9］Carthew R W，Sontheimer E J.Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs［J］.Cell，2009，136(4):642-655.

［10］Nathans R，Chu C Y，Serquina A K，et al.Cellular microRNA and P bodies modulate host-HIV-1 interactions［J］.Mol Cell，2009，34(6):696-709.

［11］Sung T L，Rice A P.miR-198 inhibits HIV-1 gene expression and replication in monocytes andits mechanism of action appears to involve repression of Cyclin T1［J］.PLoS Pathog，2009，5(1):e1000263.

［12］Liu Y P，Haasnoot J，ter Brake O，et al.Inhibition of HIV-1 by multiple siRNAs expressed from a single microRNA polycistron［J］.Nucleic Acids Res，2008，36(9):2811-2824.

［13］Aagaard L A，Zhang J，von Eije K J，et al.Engineering and optimization of the miR-106b cluster for ectopic expression of multiplexed anti-HIV RNAs［J］.Gene Ther，2008，15(23):1536-1549.

［14］Angaji S A，Hedayati S S，Poor R H，et al.Application of RNA interference in treating human diseases［J］.J Genet，2010，89(4):527-537.

［15］Tsygankov A Y.Current developments in anti-HIV/AIDS gene therapy［J］.Curr Opin Investig Drugs，2009，10(2):137-149.

［16］Chan J K，Greene W C.Dynamic roles for NF-κB in HTLV-I and HIV-1 retroviral pathogenesis［J］.Immunol Rev，2012，246(1):286-310.

［17］Shah P S，Pham N P，Schaffer D V.HIV develops indirect crossresistance to combinatorial RNAi targeting two distinct and spatially distant sites［J］.Mol Ther，2012，20(4):840-848.

［18］Friedrich B M，Dziuba N，Li G，et al.Host factors mediating HIV-1 replication［J］.Virus Res，2011，161(2):101-114.

［19］Eekels J J，Sagnier S，Geerts D，et al.Inhibition of HIV-1 replication with stable RNAi-mediated knockdown of autophagy factors［J］.Virol J，2012，9:69.

［20］Berkhout B，Sanders R W.Molecular strategies to design an escape-proof antiviral therapy［J］.Antiviral Res，2011，92(1):7-14.

［21］Ehsani A，Saetrom P，Zhang J，et al.Rational design of micro-RNA-like bifunctional siRNAs targeting HIV and the HIV coreceptor CCR5［J］.Mol Ther，2010，18(4):796-802.

［22］Shimizu S，Hong P，Arumugam B，et al.A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model［J］.Blood，2010，115(8):1534-1544.

［23］von Eije K J，ter Brake O，Berkhout B.Stringent testing identifies highly potent and escape-proof anti-HIV short hairpin RNAs［J］.J Gene Med，2009，11(6):459-467.

［24］ter Brake O，'t Hooft K，Liu Y P，et al.Lentiviral vector design for multiple shRNA expression and durable HIV-1 inhibition［J］.Mol Ther，2008，16(3):557-564.

［25］Kiem H P，Wu R A，Sun G，et al.Foamy combinatorial anti-HIV vectors with MGMTP140K potently inhibit HIV-1 and SHIV replication and mediate selection in vivo［J］.Gene Ther，2010，17(1):37-49.

［26］Liang M，Kamata M，Chen K N，et al.Inhibition of HIV-1 infection by a unique short hairpin RNA to chemokine receptor 5 delivered into macrophages through hematopoietic progenitor cell transduction［J］.J Gene Med，2010，12(3):255-265.

［27］Jackson A I，Linsley P S.Recognizing and avoiding siRNA offtarget effects for target identification and therapeutic application［J］.Nat Rev Drug Discov，2010，9(1):57-67.

［28］Reischl D，Zimmer A.Drug delivery of siRNA therapeutics:potentials and limits of nanosystems［J］.Nanomedicine，2009，5(1):8-20.

［29］Mulhbacher J，St-Pierre P，Lafontaine D A.Therapeutic applications of ribozymes and riboswitches［J］.Curr Opin Pharmacol，2010，10(5):551-556.

［30］Scarborough J，Lévesque D，Didierlaurent L，et al.In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication［J］.RNA Biol，2011，8(2):343-353.

［31］Mitsuyasu R T，Merigan T C，Carr A，et al.Phase 2 gene therapy trial of an anti-HIV ribozyme in autologous CD34+cells［J］.Nat Med，2009，15(3):285-292.

［32］Unwalla H J，Li H T，Li S Y，et al.Use of a U16 snoRNA containing ribozyme library to identify ribozyme targets in HIV-1［J］.Mol Ther，2008，16(6):1113-1119.

［33］Nazari R，Ma X Z，Joshi S.Inhibition of human immunodeficiency virus-1 entry using vectors expressing a multimeric hammerhead ribozyme targeting the CCR5 mRNA［J］.J Gen Virol，2008，89(Pt9):2252-2261.

［34］DiGiusto D L，Krishnan A，Li L，et al.RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector–modified CD34+cells in patients undergoing transplantation for AIDSrelated lymphoma［J］.Sci Transl Med，2010，2(36):36-43.

［35］Zhou J，Rossi J J.Aptamer-targeted RNAi for HIV-1 therapy［J］.Methods Mol Biol，2011，721:355-371.

［36］Hang J C，Sun L，Nie Q H，et al.Downregulation of CXCR4 expression by SDF-KDEL in CD34+hematopoietic stem cells:an anti-human immunodeficiency virus strategy［J］.J Virol Methods，2009，161(1):30-37.

［37］Bai X，Wilson K L，Seedorff J E，et al.Impact of the enfuvirtide resistance mutation N43D and the associated baseline polymorphism E137K on peptide sensitivity and six-helix bundle structure［J］.Biochemistry，2008，47(25):6662-6670.

［38］Kimpel J，Braun S E，Qiu G，et al.Survival of the fittest:positive selection of CD4+T cells expressing a membranebound fusion inhibitor following HIV-1 infection［J］.PLoS One，2010，5(8):378-384.

［39］Trobridge G D，Wu R A，Beard B C，et al.Protection of stem cell derived lymphocytes in a primate AIDS gene therapy model after in vivo selection［J］.2009.PLoS One 4(11):e7693.

［40］He Y X，Xiao Y H，Song H F，et al.Design and evaluation of sifuvirtide，a novel HIV-1 fusion inhibitor［J］.J Biol Chem，2008，283(17):11126-11134.

［41］Urnov F D，Rebar E J，Holmes M C，et al.Genome editing with engineered zinc finger nucleases［J］.Nat Rev Genet，2010，11(9):636-646.

［42］Perez E E，Wang J，Miller J C，et al.Establishment of HIV-1 resistance in CD4+T cells by genome editing using zinc-finger nucleases［J］.Nat Biotechnol，2008，26(7):808-816.

［43］Holt N，Wang J，Kim K，et al.Human hematopoietic stem/progenitor cells modified by zinc-finger nucleases targeted to CCR5 control HIV-1 in vivo［J］.Nat Biotechnol，2010，28(8):839-847.

［44］Schopman N C，ter Brake O，Berkhout B.Anticipating and blocking HIV-1 escape by second generation antiviral shRNAs［J］.Retrovirology，2010，7:52.

［45］Anderson J S，Javien J，Nolta J A，et al.Preintegration HIV-1 inhibition by a combination lentiviral vector containing a chimeric TRIM5 alpha protein，a CCR5 shRNA，and a TAR decoy［J］.Mol Ther，2009，17(12):2103-2114.

［46］Eguchi A，Meade B R，Chang Y C，et al.Efficient siRNA delivery into primary cells by a peptide［J］.Nat Biotechnol，2009，27(6):567-571.

［47］Christie R J，Nishiyama N，Kataoka K.Delivering the code:polyplex carriers for deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid interference therapies［J］.Eninology，2010，151(2):466-473.

［48］Neves J D，Amiji M M，Bahia M F，et al.Nanotechnologybased systems for the treatment and onprevention of HIV/AIDS［J］.Adv Drug Deliver Rev，2010，62(4 －5):458-477.

［49］Biffi A，Bartolomae C C，Cesana D，et al.Lentiviral vector common integration sites in preclinical models and a clinical trial reflect a benign integration bias and not oncogenic selection［J］.Blood，2011，117(20):5332-5339.

［50］Hrecka K，Hao C L，Gierszewska M，et al.Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein［J］.Nature，2011，474(7353):658-661.

［51］Bobadilla S，Sunseri N，Landau N R.Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral vector that packages the Vpx accessory protein［J］.Gene Ther，2013，20(5):514-520.

［52］Kumar P，Ban H S，Kim S S，et al.T cell-specific siRNA delivery suppresses HIV-1 infection in humanized mice［J］.Cell，2008，134(4):577-586.

［53］Kim S S，Peer D，Kumar P，et al.RNAi-mediated CCR5 silencing by LFA-1-targeted nanoparticles prevents HIV infection in BLT mice［J］.Mol Ther，2010，18(2):370-376.

［54］石英，劉寧，計云霞，等.外周血CD4++T淋巴細胞表面CCR5受體表達水平與HIV感染關系的研究［J］.首都醫(yī)科大學學報，2010，31(6):711 －714.