MMP-3 mRNA在左、右半結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系

許開(kāi)宇，連正杰，伍江平，高宏，丁磊

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京100038)

·論著·

MMP-3 mRNA在左、右半結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系

許開(kāi)宇，連正杰，伍江平，高宏，丁磊

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京100038)

目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)mRNA在左半結(jié)腸癌(LSCC)、右半結(jié)腸癌(RSCC)組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。方法 選擇結(jié)腸腺癌患者80例，以結(jié)腸脾曲為界分為L(zhǎng)SCC、RSCC各40例。取手術(shù)切除的癌組織及其配對(duì)的癌旁正常結(jié)腸組織，采用Real-time qRT-PCR法檢測(cè)不同結(jié)腸組織中MMP-3 mRNA表達(dá)，并分析其表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 LSCC及RSCC組織中MMP-3 mRNA表達(dá)均高于其配對(duì)的癌旁正常結(jié)腸組織，且LSCC組織中MMP-3 mRNA表達(dá)明顯高于RSCC組織(P<0.01)。無(wú)論LSCC還是RSCC，MMP-3 mRNA高表達(dá)均與患者脈管癌栓、異時(shí)性遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)；MMP-3 mRNA高表達(dá)與LSCC患者腫瘤浸潤(rùn)深度及癌癥相關(guān)死亡有關(guān)(P均<0.05)。Kaplan Meier生存分析顯示，MMP-3 mRNA高表達(dá)者中位生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)者(P<0.01)；分層分析發(fā)現(xiàn)，LSCC患者M(jìn)MP-3 mRNA高表達(dá)者中位生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)者(P<0.05)，MMP-3 mRNA表達(dá)對(duì)RSCC患者預(yù)后無(wú)明顯影響(P>0.05)。結(jié)論 LSCC組織中MMP-3 mRNA表達(dá)明顯高于RSCC組織；MMP-3 mRNA高表達(dá)僅是LSCC患者的不良預(yù)后因子。

左半結(jié)腸癌；右半結(jié)腸癌；基質(zhì)金屬蛋白酶3；臨床病理參數(shù)；預(yù)后

結(jié)直腸癌(CRC)是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，是具有復(fù)雜異質(zhì)性的疾病。Distler等[1]研究發(fā)現(xiàn)，左半結(jié)腸癌(LSCC)和右半結(jié)腸癌(RSCC)的臨床特征存在差異。近年來(lái)隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CRC并不遵循統(tǒng)一的致癌模式，其內(nèi)部至少存在三條致癌途徑，即染色體不穩(wěn)定(CIN)途徑、微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)途徑和鋸齒途徑(CPG島甲基化表型陽(yáng)性)[2]。CIN途徑主要累及左半結(jié)腸，MSI途徑、鋸齒途徑主要累及右半結(jié)腸。由于LSCC和RSCC的致癌機(jī)制不同，推測(cè)其內(nèi)部存在許多差異表達(dá)的基因?；|(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)是MMP家族中的間充質(zhì)溶解素之一，可直接降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)成分；有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3可與尿纖溶酶原激活物(uPA)共表達(dá)，uPA能激活纖溶酶原成纖溶酶，纖溶酶再激活proMMP-3產(chǎn)生活性MMP-3，MMP-3再作用于proMMP-9產(chǎn)生活性MMP-9，繼而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[3，4]。目前從結(jié)腸癌內(nèi)部異質(zhì)性出發(fā)研究LSCC和RSCC組織中MMP-3表達(dá)的報(bào)道較少。本研究觀察MMP-3在LSCC、RSCC組織中的表達(dá)差異，并分析其表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008～2010年在我院手術(shù)的結(jié)腸腺癌患者80例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①散發(fā)性結(jié)腸癌；②術(shù)前未進(jìn)行放化療；③接受結(jié)腸癌根治性手術(shù)，術(shù)后組織病理檢查確認(rèn)為腺癌；④有完整的臨床資料。其中，男40例、女40例，年齡(58.1±11.1)歲；腫瘤部位：盲腸癌7例，升結(jié)腸癌14例，結(jié)腸肝曲癌14例，橫結(jié)腸癌5例，結(jié)腸脾曲癌3例，降結(jié)腸癌6例，乙狀結(jié)腸癌29例，直腸乙狀結(jié)腸交界處癌2例；大體形態(tài)：隆起型23例，潰瘍型57例；組織學(xué)類型：腺癌67例，黏液腺癌13例；組織分化程度：高分化10例，中分化48例，低未分化22例；腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)：陽(yáng)性15例，陰性65例；腫瘤浸潤(rùn)深度：T356例，T424例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例；發(fā)生異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移17例，未發(fā)生異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移63例。以結(jié)腸脾曲為界，分為RSCC組40例、LSCC組40例，兩組性別、年齡等臨床病理資料相匹配。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 MMP-3 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用Real-time qRT-PCR法。①標(biāo)本處理：收集手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及其配對(duì)癌旁正常結(jié)腸組織，置于液氮中，-80 ℃冰箱凍存。②RNA提取：取冰凍組織標(biāo)本100 mg，液氮下研磨、勻漿化，加入TRI Reagent 1 mL，用氯仿和異丙醇依次超速離心抽提，總RNA用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后，用DNase Ⅰ去除總RNA中的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA條帶，并用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度和濃度。③cDNA合成和mRNA檢測(cè)：取總RNA 2 μg，70 ℃變性5 min；在20 μL終反應(yīng)體系[Oligo(dT)180.5 μg，1×第一鏈合成緩沖液，RNase酶抑制劑20 U，10 mmol/L each dNTP,H Minus M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U，DEPC水]中42 ℃逆轉(zhuǎn)錄1 h。采用iCycler iQ實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行Taqman探針?lè)≧eal-time qPCR擴(kuò)增。引物序列：MMP-3上游引物5′-GAACCTGTCCCTCCAGAACCT-3′，下游引物5′-CGCCAAAAGTGCCTGTCTTTAA-3′；內(nèi)參基因(ACTB)上游引物5′-GACTACCTCATGAAGATCCTCACC-3′，下游引物5′- CCATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3′。探針序列：MMP-3：ACGCCAGCCAACTGTGATCCTGCT，

ACTB：CGGCTACAGCTTCACCACCACGGC。引物序列由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，探針序列由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。每個(gè)樣品做2個(gè)平行反應(yīng)，腫瘤組織平行反應(yīng)Ct值相差小于0.5，正常組織相差小于1。根據(jù)Ct值用擴(kuò)增效率校正相對(duì)定量法公式[5, 6]，計(jì)算出每個(gè)樣品經(jīng)看家基因ACTB標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)量。考慮到正常左半、右半結(jié)腸組織中MMP-3的本底表達(dá)量可能存在差異，以MMP-3 mRNA在結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中的比值，即表達(dá)指數(shù)(F)表示結(jié)腸癌組織中MMP-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。最后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證。以F的中位數(shù)為界將患者分為MMP-3 mRNA高表達(dá)者和低表達(dá)者，分析不同MMP-3 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1.3 隨訪 隨訪截至2013年3月，觀察患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和生存狀況。

2 結(jié)果

2.1 不同結(jié)腸組織中MMP-3 mRNA表達(dá)比較 RSCC組MMP-3 mRNA表達(dá)量為(1.01±2.83)×10-3，其配對(duì)癌旁正常結(jié)腸組織為(4.50±8.06)×10-5；LSCC組MMP-3 mRNA表達(dá)量為(4.20±44.4)×10-3，其配對(duì)癌旁正常結(jié)腸組織為(8.50±29.60)×10-5。RSCC組和LSCC組MMP-3 mRNA表達(dá)均顯著高于其配對(duì)癌旁正常結(jié)腸組織(P均<0.01)。RSCC組MMP-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為24.87±52.11，LSCC組為90.23±112.70，兩組比較P<0.01。RSCC組MMP-3 mRNA高表達(dá)者及低表達(dá)者分別為12、28例， LSCC組分別為28、12例。

2.2 不同MMP-3 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 RSCC組MMP-3 mRNA高表達(dá)者及低表達(dá)者年齡分別為(57.8±12.9)、(55.5±11.1)歲，腫瘤最大直徑分別為(4.3±2.0)、(5.4±2.2)cm，二者比較P均>0.05。LSCC組MMP-3 mRNA高表達(dá)者與低表達(dá)者年齡分別為(59.8±12.2)、(59.3±8.5)歲，腫瘤最大直徑分別為(4.4±1.9)、(3.7±1.3)cm，二者比較P均>0.05。RSCC組與LSCC組MMP-3 mRNA高表達(dá)者與脈管癌栓和異時(shí)性遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)(P均<0.05)； MMP-3 mRNA高表達(dá)還與LSCC患者腫瘤浸潤(rùn)深度和癌相關(guān)死亡有關(guān)。不同MMP-3 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。

2.3 不同MMP-3 mRNA表達(dá)者生存情況 所有患者隨訪時(shí)間7～71個(gè)月、平均39.2個(gè)月。Kaplan Meier生存分析顯示，兩組40例MMP-3 mRNA高表達(dá)者中位生存時(shí)間為46.8個(gè)月，40例低表達(dá)者中位生存時(shí)間為64.3個(gè)月，二者比較P<0.01。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，LSCC組 MMP-3 mRNA低表達(dá)者中位生存時(shí)間為64.0個(gè)月，高表達(dá)者為45.7個(gè)月，二者比較P<0.05；RSCC組低表達(dá)者與高表達(dá)者中位生存時(shí)間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖1。

3 討論

由于LSCC和RSCC的致癌機(jī)制不用，有研究將二者作為不同類型的腫瘤，并認(rèn)為其內(nèi)部存在許多差異表達(dá)的基因[7,8]。MMP-3是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的間充質(zhì)溶解素之一。原位雜交技術(shù)證實(shí)，MMP-3不是腫瘤細(xì)胞合成的，而是由間質(zhì)的纖維母細(xì)胞產(chǎn)生，尤其在出現(xiàn)侵襲的癌細(xì)胞最明顯，合成后即直接轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞表面， 賦予癌細(xì)胞浸潤(rùn)所需的蛋白酶。MMP-3不僅可通過(guò)直接降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)成分(如纖維連接蛋白、層黏連蛋白以及Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ、Ⅹ型膠原等)發(fā)揮作用，還可間接通過(guò)激活MMP-9發(fā)揮作用;其不僅與CRC的轉(zhuǎn)化有關(guān)[9]，還可參與其侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。因而MMP-3是與CRC預(yù)后相關(guān)的潛在基因。目前研究認(rèn)為，MSI CRC和MSS CRC 是不同致癌途徑下的兩個(gè)結(jié)腸癌亞群，前者與RSCC，后者與LSCC有關(guān)。Moran等[4]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3在不同結(jié)腸癌亞群中表達(dá)不一，其在高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)CRC中表達(dá)明顯低于低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定/微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSI-L/MSS)CRC。推測(cè)MMP-3可能是RSCC和LSCC兩個(gè)不同亞群間潛在差異表達(dá)并與患者預(yù)后相關(guān)的基因。

表1 RSCC組及LSCC組 MMP-3 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，MMP-3 mRNA在RSCC、LSCC組織中的表達(dá)均明顯高于其配對(duì)的正常結(jié)腸組織，與前期在MMP-3蛋白表達(dá)水平上的研究相符[10～12]。本研究還發(fā)現(xiàn)，LSCC組織中MMP-3 mRNA表達(dá)明顯高于RSCC組織。Moran等[4]研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中MMP-9表達(dá)在MSI-H腫瘤中高于其對(duì)應(yīng)的MSI-L/MSS腫瘤，但MSI-H腫瘤中MMP-9的活性卻明顯低于MSI-L/MSS腫瘤；進(jìn)一步對(duì)MMP-9的前體內(nèi)源激活物MMP-3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MMP-3在MSI腫瘤中的表達(dá)明顯低于MSI-L/MSS腫瘤，從而解釋了MMP-9在MSI-H腫瘤中較MSI-L/MSS腫瘤表達(dá)高但其活性低的原因。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3啟動(dòng)子5A多態(tài)性是腫瘤形成和進(jìn)展的危險(xiǎn)因素之一[13]。此區(qū)域的單核苷酸重復(fù)序列是CRC MSI途徑易累及的靶結(jié)構(gòu)，MMP-3啟動(dòng)子在這個(gè)水平發(fā)生的插入/缺失突變見(jiàn)于散發(fā)性MSI-H CRC，而且這些移碼突變和MMP-3表達(dá)下降相關(guān)，相反在MSI-L/MSS腫瘤中不存在這種移碼突變，證實(shí)MMP-3啟動(dòng)子是CRC MSI途徑的新靶點(diǎn)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3 mRNA在RSCC組織中的表達(dá)明顯低于LSCC組織，推測(cè)與RSCC組織中MMP-3啟動(dòng)子的MSI狀態(tài)有關(guān)。

MMP-9是降解Ⅳ膠原最重要的膠原酶之一。通過(guò)MMP-3直接激活proMMP-9[14,15]，MMP-9才能導(dǎo)致CRC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[3]。MMP-3還可通過(guò)其蛋白溶解活性釋放多種細(xì)胞表面分子，如E-cadherin，具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的重要作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3 mRNA高表達(dá)與脈管癌栓和異時(shí)性遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移的發(fā)生密切相關(guān)；與LSCC患者腫瘤浸潤(rùn)深度和癌相關(guān)死亡顯著相關(guān)，而在RSCC患者中則無(wú)相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)， MMP-3 mRNA高表達(dá)者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)者；分層分析發(fā)現(xiàn)，MMP-3 mRNA高表達(dá)與LSCC患者預(yù)后較差有關(guān)，而與RSCC患者預(yù)后無(wú)關(guān)。

綜上所述，MMP-3 mRNA在LSCC組織中的表達(dá)明顯高于RSCC組織；MMP-3 mRNA高表達(dá)僅是LSCC患者的不良預(yù)后因子。

[1] Distler P, Holt PR. Are right-and left-sided colon neoplasms distinct tumors[J]. Dig Dis, 1997,15(4-5):302-311.

[2] Simons CC, Hughes LA, Smits KM, et al. A novel classification of colorectal tumors based on microsatellite instability, the CpG island methylator phenotype and chromosomal instability: implications for prognosis[J]. Ann Oncol, 2013,24(8):2048-2056.

[3] Inuzuka K, Ogata Y, Nagase H, et al. Significance of coexpression of urokinase-type plasminogen activator, and matrix metalloproteinase 3 (stromelysin) and 9 (gelatinase B) in colorectal carcinoma[J]. J Surg Res, 2000,93(2):211-218.

[4] Moran A, Iniesta P, de Juan C, et al. Stromelysin-1 promoter mutations impair gelatinase B activation in high microsatellite instability sporadic colorectal tumors[J]. Cancer Res, 2002,62(13):3855-3860.

[5] 張馳宇，徐順高，黃新祥.一種新穎簡(jiǎn)便的熒光實(shí)時(shí)RT-PCR相對(duì)定量方法的建立[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005，32(9)：883-887.

[6] Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res, 2001,29(9):e45.

[7] Kapiteijn E, Liefers GJ, Los LG, et al. Mechanisms of oncogenesis in colon versus rectal cancer[J]. J Pathol, 2001,195(2):171-178.

[8] Konishi K, Fujii T, Boku N, et al. Clinicopathological differences between colonic and rectal carcinomas: are they based on the same mechanism of carcinogenesis[J]. Gut, 1999,45(6):818-821.

[9] Sipos F, Germann TM, Wichmann B, et al. MMP3 and CXCL1 are potent stromal protein markers of dysplasia-carcinoma transition in sporadic colorectal cancer[J]. Eur J Cancer Prev, 2014,23(5):336-343.

[10] Baker EA, Bergin FG, Leaper DJ. Matrix metalloproteinases, their tissue inhibitors and colorectal cancer staging[J]. Br J Surg, 2000,87(9):1215-1221.

[11] Islekel H, Oktay G, Terzi C, et al. Matrix metalloproteinase-9, -3 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in colorectal cancer: relationship to clinicopathological variables[J]. Cell Biochem Funct, 2007,25(4):433-441.

[12] Bodey B, Bodey B Jr, Siegel SE, et al. Prognostic significance of matrix metalloproteinase expression in colorectal carcinomas[J]. In Vivo, 2000,14(5):659-666.

[13] Biondi ML, Turri Q, Leviti S, et al. MMP1 and MMP3 polymorphisms in promoter regions and cancer[J]. Clin Chem, 2000,46(12):2023-2024.

[14] Ogata Y, Enghild JJ, Nagase H. Matrix metalloproteinase 3 (stromelysin) activates the precursor for the human matrix metalloproteinase 9[J]. J Biol Chem, 1992,267(6):3581-3584.

[15] Ramos-DeSimone N, Hahn-Dantona E, Sipley J, et al. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion[J]. J Biol Chem, 1999,274(19):13066-13076.

[16] Sternlicht MD, Bissell MJ, Werb Z. The matrix metalloproteinase stromelysin-1 acts as a natural mammary tumor promoter[J]. Oncogene, 2000,19(8):1102-1113.

Differential expression of MMP-3 mRNA in left-sided and right-sided colon cancer and its relationships with clinicopathological parameters and prognosis

XUKaiyu,LIANZhengjie,WUJiangping,GAOHong,DINGLei

(BeijingShijitanHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100038,China)

Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase 3 (MMP-3) mRNA in the left-sided and right-sided colon cancer and its relationships with clinicopathological parameters and prognosis. Methods Eighty patients with colonic adenocarcinoma were divided into the left-sided colon cancer (LSCC) group and right-sided colon cancer (RSCC) group with forty patients in each by the boundary of splenic flexure. Eighty paired specimens were collected from each patient’s cancer tissues and itself normal colon mucosal tissues. The mRNA expression of MMP-3 was detected in two subgroups by real-time quantitative RT-PCR. Subsequently, the relationships between the expression and clinicopathological parameters as well as prognosis of each subgroup were analyzed. Results The mRNA expression of MMP-3 in the colon cancer tissues was significantly higher than that in the normal colon mucosa, and the MMP-3 mRNA expression in LSCC was higher than that in RSCC (P<0.01). In the Pearsonχ2test, the high expression of MMP-3 was closely related with lymphatic/vascular invasion and metachronous distant metastasis for both RSCC and LSCC (allP<0.05). The high expression of MMP-3 mRNA was also closely related with depth of invasion and cancer-related death of LSCC patients (allP<0.05). Kaplan-Meier analysis showed that the high MMP-3 mRNA expression group had the poorer median survival time than that of the low expression group (P<0.01), and the stratification analysis showed the median survival time of RSCC patients with high expression of MMP-3 was less than that of low expression one (P<0.05). The expression of MMP-3 mRNA had no effect on the prognosis of patients (P>0.05). Conclusion The expression of MMP-3 mRNA in the LSCC tissues is significantly higher than that in RSCC tissues, and the high expression of MMP3 is only a poor prognostic factor for LSCC patients.

left-sided colon carcinoma; right-sided colon carcinoma; matrix metalloproteinase 3; clinicopathological parameter; prognosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372585)；第46批教育部“留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金”。

許開(kāi)宇(1973-)，男，博士，研究方向?yàn)槲改c腫瘤。E-mail：xvkaiyv@sina.com

丁磊(1971-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)榻Y(jié)直腸癌的基礎(chǔ)和臨床。E-mail：dinglei1005@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.001

R735.3

A

1002-266X(2016)24-0001-04

2016-04-20)