小薊酸水提取物對巴馬小型豬心肌的影響

陳 菲 王建美 裘穎兒 盛柳青

1. 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)部，浙江金華 321007；2.浙江省金華食品藥品檢驗所動物中心，浙江金華 321007

小薊為菊科植物刺兒菜Cirsium Setosum（Willd.） MB.的干燥地上部分，目前也有以菊科植物刻葉刺兒菜Cephalanoplos segetum（Bge.）Kitam.的干燥地上部分作為小薊入藥。 刺兒菜分布于中國大部分地區(qū)，在東歐、中歐、俄羅斯東部、日本、朝鮮等地區(qū)也有分布。 刺兒菜一般生于荒地、草地、田間、林緣及溪旁，夏、秋二季花開時采割，除去雜質(zhì)，曬干，生用或炒炭用[1-2]。

小薊性涼、味甘、苦，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀消腫、涼血止血之功效，用于衄血、吐血、尿血、便血、崩漏下血、外傷出血等。 現(xiàn)代研究表明，小薊含膽堿、兒茶酚胺類、皂苷、甾醇、有機酸、生物堿等成分，其提取物有明顯的收縮血管、縮短凝血時間的作用[3-4]。 為了利用小薊的藥理活性建立巴馬小型豬慢性心肌缺血模型，本實驗制備了小薊酸水提取物注射液，采用腹腔注射的方式給藥，并以心電圖、血清心肌酶譜、心肌染色結(jié)果為評價指標(biāo)考察了該提取物對正常巴馬小型豬心肌的影響，現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

巴馬小型豬30 只，雄20 只，雌10 只，體重10～15 kg，月齡3～5 個月，由上海甲干生物科技有限公司提供（許可證號SCXK 滬2010-0028），全價顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 儀器與試藥

恒溫水浴鍋（杭州藍天化驗儀器廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海青浦滬西儀器廠），RM6200 型心電圖機（成都儀器設(shè)備廠），101 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司），SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵（深圳市瑞鑫達化玻儀器有限公司），ACS-3 型電子計價秤（金華市征龍衡器有限公司），SGP-P 型不銹鋼平板微孔濾膜過濾器（上海格式過濾設(shè)備有限公司）。小薊由金華市藥材供應(yīng)站提供并經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院吳遠文副教授鑒定，異丙腎上腺素注射液（0.5 mg/mL，上海禾豐制藥有限公司），氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC，Sigma 公司）等。

1.3 小薊酸水提取物注射液的制備

準(zhǔn)確稱取干燥的小薊藥材15 kg，切碎，加水浸泡30 min，酸水提取2 次，第1 次加8 倍量的酸水（pH 值2～3）煎煮40 min，第2 次加5 倍量的酸水（pH 值3～4）煎煮30 min。 提取液用雙層紗布濾過，合并濾液并濃縮至約7500 mL（每毫升相當(dāng)于生藥2 g）。 濃縮液加乙醇進行醇沉處理2 次，第1 次使含醇量達65%，第2 次使含醇量達85%，每次醇沉后靜置冷藏48 h，雙層濾紙抽濾，濾液減壓回收乙醇，濃縮至3000 mL（每毫升相當(dāng)于生藥5 g）。調(diào)節(jié)pH 值至4～5，過濾，加注射用水至3800 mL，繼續(xù)調(diào)節(jié)pH 值至4～5。 加入0.2%活性炭，煮沸10 min，稍冷后抽濾，濾液加亞硫酸氫鈉10g，溶解后，加注射用水至5000 mL。0.45 μm微孔濾膜過濾，灌封（規(guī)格為每支5 mL，每毫升含生藥3 g），流通蒸汽100℃滅菌30 min。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及處理

試驗前小型豬常規(guī)飼養(yǎng)7 d，將小型豬30 只隨機分為5 組：正常對照組、小薊酸水提取物低劑量組（低劑量組）、小薊酸水提取物中劑量組（中劑量組）、小薊酸水提取物高劑量組（高劑量組）、異丙腎上腺素陽性對照組（陽性對照組），每組各6 只。 每日同一時間腹腔注射給藥1 次，小薊酸水提取物組給予劑量分別為2.0 mL/kg、1.0 mL/kg、0.5 mL/kg（相當(dāng)于給予生藥6 g/kg、3 g/kg、1.5 g/kg），正常對照組給予等量生理鹽水，陽性對照組給予異丙腎上腺素1.0 mL/kg（即異丙腎上腺素0.5 mg/kg）。每只動物均給藥7 d 后采集數(shù)據(jù)。

1.4.2 檢測指標(biāo)

1.4.2.1 心電圖檢測 在做心電圖前，各組小型豬采用人力保定（3 人配合把小型豬仰臥固定在專用實驗臺上，將小型豬四肢用寬紗布固定在實驗臺四周的鐵鉤上，輕輕安撫小型豬，使其平復(fù)并處于安靜狀態(tài)）。 把小型豬胸部和腿部接觸導(dǎo)聯(lián)部位剃毛后，用75%酒精擦拭導(dǎo)聯(lián)部位，接上動物專用導(dǎo)電夾，走紙速度25 mm/s，利用心電圖機V1 導(dǎo)聯(lián)描記各組小型豬心電圖。

1.4.2.2 血清心肌酶譜檢測 各組小型豬采用人力保定，每只于前腔靜脈處采血約3 mL[5]，采血后立即離心和分離出血清，避免產(chǎn)生溶血。 精密量取0.5 mL 血清分別置于自動生化分析儀和電化學(xué)發(fā)光儀上檢測，其中血清中的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移 酶（aspartate amino transferase，AST）的 檢 測 在 自動生化分析儀上完成，CK-MB 采用免疫抑制法檢測，其他3 種心肌酶采用速率法檢測；血清中的肌鈣蛋白T（troponin T，TNT）的檢測在電化學(xué)發(fā)光儀上完成，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測。 以上指標(biāo)的檢測均由浙江杭州迪安醫(yī)學(xué)檢測中心完成，有配套試劑盒，專人操作。

1.4.2.3 TTC 染色觀察心肌變化 各組小型豬隨機抽取1 只，在采血和心電圖檢測完成后，處死，迅速開胸取出心臟，取生理鹽水沖洗干凈，垂直于心臟長軸，自心尖向心底將心臟切成短軸面切片，然后置于1%TTC 磷酸鹽緩沖液中，放入37℃恒溫干燥箱20 min 之后在10%福爾馬林中固定。 正常心肌染色呈磚紅色，壞死心肌呈灰白色或灰黃色[6-7]，觀察標(biāo)本的壞死心肌和壞死范圍。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。 計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。 以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗過程中動物的死亡情況

30 只小型豬，陽性對照組在藥物注射第5 天死亡1 只，在藥物注射第6 天死亡1 只，小薊酸水提取物中劑量組在藥物注射第4 天死亡1 只。

2.2 心電圖檢測情況

各組小型豬的心電圖（圖1）所示，其中低劑量組的心電圖與正常對照組的心電圖基本一致，中劑量組的心電圖與正常對照組比較，Q-T 間隙延長，出現(xiàn)較大T 波，且S-T 段（自QRS 波群的終點至T 波起點的一段水平線）稍有抬高現(xiàn)象。 高劑量組的心電圖T 波高尖，R 波振幅降低，S-T 段抬高較中劑量組明顯，且出現(xiàn)病理性Q 波。 陽性對照組的心電圖出現(xiàn)高大T波，S-T 段抬高較其他組明顯。 從心電圖可以看出，高劑量組和陽性對照組呈典型心肌缺血的心電圖。

2.3 血清心肌酶譜檢測結(jié)果

圖1 各組心電圖

結(jié)果顯示：與正常對照組比較，陽性對照組心肌酶譜各指標(biāo)明顯提高，特別是TNT 的升高極顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。 低劑量組與正常對照組比較，血清各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；中劑量組與正常對照組比較，血清LDH、CK-MB 兩指標(biāo)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；高劑量組與正常對照組比較，除TNT 升高不明顯外，其他指標(biāo)均有明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。 以上血清心肌酶譜檢測結(jié)果在一定程度上說明了小薊酸水提取物對心肌的影響與劑量有關(guān)。 見表1。

表1 小薊酸水提取物對小型豬心肌酶譜的影響（）

表1 小薊酸水提取物對小型豬心肌酶譜的影響（）

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05；AST：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；LDH：乳酸脫氫酶；CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶；TNT：肌鈣蛋白T

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2.4 TTC 心肌染色結(jié)果

陽性對照組發(fā)生心肌壞死的范圍相對較大，大多分布在室間隔附近，高劑量組在室間隔有少部分發(fā)生心肌壞死，中劑量組僅在左心室部分發(fā)生很小面積的壞死，低劑量組的心肌呈現(xiàn)完全的磚紅色，無心肌壞死發(fā)生。TTC 染色結(jié)果顯示了小薊酸水提取物在一定程度上能誘發(fā)心肌缺血。

3 討論

本研究組在前期對小薊不同提取條件下的提取物誘導(dǎo)心肌缺血的實驗進行了初步摸索，初步證實了酸水提取物的誘導(dǎo)作用。本次實驗采用經(jīng)典的誘發(fā)心肌缺血的藥物——異丙腎上腺素作陽性對照[8-9]，觀察了不同劑量小薊酸水提液對巴馬小型豬心肌的影響，結(jié)果顯示高劑量小薊酸水提液（生藥6 g/kg）對誘發(fā)心肌缺血有一定作用。這可能與酸水提液中堿性成分相對濃集，而這些堿性成分有可能通過促進冠脈血管收縮和增加心肌耗氧量等多方面機制誘發(fā)心肌缺血壞死。至于這些堿性物質(zhì)的成分有待實驗的進一步確證。

本研究組采用了多種評價指標(biāo)考察小薊酸水提液對小型豬心肌的影響，其中心電圖能較為敏感反映心肌病變狀況，因此實驗把心電圖的異常作為評價心肌缺血的主要指標(biāo)，同時結(jié)合血清中AST、LDH、CK、CK-MB、TNT 等生化指標(biāo)以及心肌壞死面積等指標(biāo)來探討小型豬心肌缺血的程度[10-12]。

心電圖出現(xiàn)ST-T 異常改變可間接反映心肌的損傷，當(dāng)心肌某一部分缺血時，將影響到心室復(fù)極的正常進行，并可在與缺血區(qū)相關(guān)導(dǎo)聯(lián)上發(fā)生ST-T 異常改變。 如出現(xiàn)T 波變化，可表現(xiàn)為出現(xiàn)高大直立的T 波或T 波倒置的情況，還有一個典型表現(xiàn)是發(fā)生ST 段偏移，表現(xiàn)為ST 段抬高或壓低現(xiàn)象，另外是在心電圖上出現(xiàn)病理性Q 波。 心肌缺血的心電圖改變類型取決于缺血的嚴(yán)重程度、持續(xù)時間和缺血發(fā)生部位[13-14]。本次實驗中高劑量組出現(xiàn)了高尖T 波和較明顯的ST段抬高以及病理性Q 波，驗證了小薊酸水提物對心肌的損傷作用，但其T 波高尖程度和ST 段抬高程度明顯不如異丙腎上腺素陽性對照組，這也從側(cè)面說明小薊引起心肌損傷的程度并不嚴(yán)重。

血清中的各生化指標(biāo)是心肌缺血、心肌細胞損傷所釋放的介質(zhì)，可以反映心肌缺血及其損傷程度。當(dāng)心肌細胞發(fā)生損傷時，由于細胞內(nèi)Ca2+超載可激活磷脂酶，使膜磷脂分解和細胞膜的通透性增加，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)包括心肌酶和肌鈣蛋白釋放到血清中。 這些大分子物質(zhì)統(tǒng)稱為心肌損傷標(biāo)志物，包括AST、LDH、CK、CK-MB、TNT 等，其中TNT 和CK-MB主要在心肌中分布，因此它們對判斷心肌損傷特異性最高[15-16]。 本實驗中中劑量組和高劑量組CK-MB 的增加幅度都較其他組心肌酶明顯，顯示了CK-MB 檢測的特異程度，但同時各劑量組TNT 的水平和正常對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），而陽性對照組TNT 的水平卻很高，這其中的原因有待實驗的進一步探究。

TTC 染色是一種用于評價組織內(nèi)脫氫酶活性的標(biāo)本染色方法，與組織形態(tài)學(xué)方法比較，該種染色法成本低廉、簡單易行。TTC 是一種脂溶性光敏感物質(zhì)，1894 年首次合成用以檢測種子的生存能力，從1958 年開始用作染料檢測哺乳動物的缺血梗死。其主要機制是TTC 能與心肌組織中的脫氫酶反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，正常組織因細胞內(nèi)具有完整的脫氫酶系統(tǒng)，TTC可通過胞膜進入胞內(nèi)，與脫氫酶結(jié)合反應(yīng)呈現(xiàn)紅色，而壞死組織由于缺乏完整的脫氫酶系統(tǒng)而不染色[17-18]。從本實驗心肌染色結(jié)果來看，除了低劑量組，中高劑量組都有不同程度的泛白區(qū)存在，這也與前面的心電圖和血清生化指標(biāo)的檢測存在一致性。

在做小型豬心電圖實驗時，開始本研究組曾采用靜脈注射丙泊酚和戊巴比妥鈉的方式使小型豬鎮(zhèn)靜，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，由于麻醉引起動物基礎(chǔ)體溫下降，小型豬出現(xiàn)顫抖等一系列應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致心電圖的基線不穩(wěn)定，無法得到正常的心電圖。 后采用合理人力保定并輔以適當(dāng)安撫的方式，做出的心電圖基線穩(wěn)定，重復(fù)性好。

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