莪術(shù)不同炮制品中倍半萜及姜黃素類成分的比較

劉會(huì)珍， 陸兔林,2* ， 毛春芹， 季 德,2， 李 林， 王若衡

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)CurcumaphaeocaulisValeton、廣西莪術(shù)CurcumakwangsiensisS.G.Lee etl.F.Liang或溫郁金CurcumawenyujinY·H·Chen et C·Ling的干燥根莖[1]，具有破氣行血、消積止痛的功效和抗癌、抗病毒、抗炎、抗凝血、抗氧化和保肝等生理作用。臨床常用飲片有生莪術(shù)、醋炙莪術(shù)和醋煮莪術(shù)，生莪術(shù)行氣消積力強(qiáng)，醋制后主入肝經(jīng)血分，增強(qiáng)散瘀止痛作用，療效顯著[2-3]。莪術(shù)中的主要活性成分包括以莪術(shù)二酮、吉馬酮等為代表的倍半萜類成分[4-8]，以及姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素為代表的姜黃素類成分(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道莪術(shù)中的倍半萜類具有抗病毒和抗腫瘤活性[9]。藥理研究表明莪術(shù)二酮具有顯著抗凝血和抗血栓形成作用[10]，是莪術(shù)中的主要活性成分；吉馬酮(牻牛兒酮)性質(zhì)穩(wěn)定，且具有抗腫瘤等方面的活性[11]，是《中國(guó)藥典》2010年版中莪術(shù)薄層鑒別的指標(biāo)性成分。同時(shí)莪術(shù)中的姜黃素類成分也具有抗癌、抗早孕、抗凝血、抗氧化和保肝等廣泛的藥理活性[12-13], 且毒性低。因此，僅以倍半萜類成分或姜黃素類成分作為莪術(shù)測(cè)定的指標(biāo)是不完善的，本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定莪術(shù)不同炮制品中的倍半萜及姜黃素類成分，并比較醋制前后這兩大類活性成分的變化，對(duì)揭示中藥炮制內(nèi)涵，制定醋莪術(shù)加工炮制規(guī)范和飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重大意義。

圖1 莪術(shù)中倍半萜及姜黃素類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Agilent1200型高效液相色譜儀(包括在線脫氣系統(tǒng)、雙元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器)，KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，Mettler AG285電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))，F(xiàn)A1104型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4(國(guó)華電器有限公司)。Milli-Q超純水，乙腈為色譜純，甲酸(分析純，南京試劑廠)。甲醇(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

莪術(shù)二酮(批號(hào)13657-68-6，上海滬云醫(yī)藥開(kāi)發(fā)有限公司)；吉馬酮對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111665-200902)；雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，供含量測(cè)定用)；姜黃素( 中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110823-200603)。

莪術(shù)藥材購(gòu)自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，均來(lái)源于其主產(chǎn)地(浙江、廣西、四川)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院巢建國(guó)教授鑒定，分別為姜科植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling、廣西莪術(shù)CurcumakwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang及蓬莪術(shù)CurcumaphaeocaulisVal.的干燥根莖。

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版莪術(shù)飲片制法項(xiàng)下制得生莪術(shù)飲片、醋制莪術(shù)飲片和醋煮莪術(shù)飲片。樣品來(lái)源及品種見(jiàn)表1。

表1 樣品來(lái)源及鑒定結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 生飲片 取原藥材, 大小分檔, 洗凈, 剪去須根,蒸制透心，趁熱切薄片, 干燥, 篩去碎屑作為生品(飲片)。

2.1.2 醋炙飲片 取生品(飲片), 加定量米醋拌勻,稍悶潤(rùn), 待醋汁被吸盡后, 置炒制容器內(nèi), 用文火加熱,炒至微黃色, 略帶焦斑時(shí), 取出, 放涼。每100 kg莪術(shù)用米醋20 kg。

2.1.3 醋煮飲片 取原藥材置煮制容器內(nèi), 加米醋及適量水浸沒(méi), 用文火煮至醋汁被吸盡, 內(nèi)無(wú)白心時(shí),取出, 稍晾, 切薄片, 干燥。每100 kg莪術(shù)用米醋20 kg。

2.2 色譜條件 Hanbon ODS-2 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.05%甲酸乙腈(A)-0.05%甲酸水(B)，梯度洗脫(0～20 min，45%～55% A；20～40 min，55%～75%A;40～50 min，75%～90%A；50～65 min，90%～100%A)，下一個(gè)循環(huán)前用45%的乙腈平衡10 min；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm和430 nm，進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照品(A)及莪術(shù)飲片(B)、醋炙飲片(C)和醋煮飲片(D)的高效液相色譜圖

2.3 溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取莪術(shù)二酮、吉馬酮、姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品適量，加甲醇分別制成單個(gè)對(duì)照品貯備液。分別精密取各貯備液適量，配制成混合對(duì)照品貯備液，以上5個(gè)化合物在混合對(duì)照品貯備液中的質(zhì)量濃度分別為0.167 4、 0.040 6、0.017 3、0.019 3、0.001 1 mg/mL。

2.3.2 供試品溶液的制備 莪術(shù)飲片粉碎過(guò)三號(hào)篩(50目)，取粉末0.5 g，精密稱定，加50 mL 90%乙醇，索氏回流提取至提取溶劑無(wú)色，50 ℃水浴揮干溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，定容? mL，搖勻，過(guò)微孔濾膜(0.45 μm)，20 μL進(jìn)樣。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液 1、6、10、16、20 μL進(jìn)樣分析，每個(gè)體積進(jìn)樣2次，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積平均值對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為：莪術(shù)二酮y=478.82x+0.162 8，r=1.000 0；吉馬酮y=2 049.8x-3.217 8，r=1.000 0；雙去甲氧基姜黃素y=4 890.7x-2.220 4，r=1.000 0；去甲氧基姜黃素y=5 301.1x-5.724 4，r=1.000 0；姜黃素y=4 660.8x-5.571，r=1.000 0；結(jié)果表明莪術(shù)二酮在8.37～167.5 μg/mL、吉馬酮在2.03～40.59 μg/mL、雙去甲氧基姜黃素在0.23～1.14 μg/mL、去甲氧基姜黃素在0.99～19.8 μg/mL、姜黃素在0.89～17.8 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液，于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定莪術(shù)二酮、吉馬酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的峰面積值，計(jì)算得其RSD值，分別為0.74%、1.22%、1.56%、1.12%和0.68%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μL分別于制備后0、6、12、 24、 48 h進(jìn)樣，測(cè)定莪術(shù)二酮、吉馬酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的峰面積，RSD值分別為1.72%、0.62%、2.47%、1.34%、1.33%。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取莪術(shù)粉末(批號(hào)120506)約0.5 g，共6份，精密稱定，按“2.3.2”項(xiàng)下制備樣品，測(cè)定莪術(shù)二酮、吉馬酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的平均含有量為0.377 6、0.300 6、0.006 5、0.1219、0.129 4 mg/g，RSD值分別為4.2%、6.5%、1.5%、1.4%、1.5%。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱取已知5個(gè)成分含有量的莪術(shù)粉末(批號(hào)120506)約0.25 g，共9份。根據(jù)樣品中各成分量的80%、100%與120%，分別加入對(duì)照品溶液各3份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算回收率。結(jié)果莪術(shù)二酮、吉馬酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的加樣回收率分別為103.4%、100.1%、98.3%、96.8%、100.5%，RSD值分別為0.3%、1.1%、1.9%、1.3%、2.2%。

2.9 樣品測(cè)定 取各批次莪術(shù)生飲片、醋炙飲片和醋煮飲片樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份樣品平行3份，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算5種成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 莪術(shù)不同炮制品中倍半萜和姜黃素類成分的測(cè)定(n=3)

與相應(yīng)生品相比，醋炙飲片和醋煮飲片中這5個(gè)活性成分的量均有不同程度的下降，樣品CIK110522中雙去甲氧基姜黃素的量較其相應(yīng)生品CK110522有所升高,與整體變化趨勢(shì)稍有差異。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 鑒于待測(cè)樣品中包含兩種不同類型的成分，本實(shí)驗(yàn)首先考察了兩種不同的流動(dòng)相系統(tǒng)(甲醇-水和乙腈-水)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫無(wú)法使倍半萜類和姜黃素類成分分離，且峰形不好；乙腈-水系統(tǒng)可以使倍半萜類(莪術(shù)二酮、吉馬酮)分離，但無(wú)法使姜黃素類成分分離良好；查閱文獻(xiàn)后，在乙腈和水中分別加酸以使姜黃素類成分達(dá)到基線分離，分別考察了不同種類的酸和加入酸的比例，結(jié)果0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水系統(tǒng)梯度洗脫，可以使姜黃素類成分達(dá)到基線分離并不對(duì)倍半萜類(莪術(shù)二酮、吉馬酮)產(chǎn)生影響。同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，最終確定莪術(shù)二酮、吉馬酮的檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm，姜黃素類成分的檢測(cè)波長(zhǎng)為430 nm。

3.2 供試品溶液的制備 在供試品溶液的制備過(guò)程中，考察了不同的提取溶劑(乙醚、甲醇、無(wú)水乙醇和90%乙醇)和不同的提取方法(超聲提取和索氏回流提取)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90%乙醇索氏回流提取至提取溶劑無(wú)色，提取效果較好，這兩類成分均能得到最佳提取且色譜峰峰形較好。

3.3 小結(jié) 醋炙莪術(shù)飲片、醋煮莪術(shù)飲片中莪術(shù)醇、吉馬酮和姜黃素類化合物的量均低于生莪術(shù)飲片。莪術(shù)二酮和吉馬酮為倍半萜類化合物，熔沸點(diǎn)較低，醋炙與醋煮過(guò)程中加熱易造成這些成分的揮發(fā)，故炮制后含有量降低。此外，莪術(shù)二酮在加熱條件下發(fā)生熱重排反應(yīng)轉(zhuǎn)化成莪術(shù)醇[14]，但相同條件下莪術(shù)醇不能轉(zhuǎn)化成莪術(shù)二酮，可能是莪術(shù)二酮炮制后含有量降低的原因之一。姜黃素類性質(zhì)不穩(wěn)定，在加熱和酸性條件下可能發(fā)生降解而導(dǎo)致含有量降低，降解過(guò)程及規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

此外， 批號(hào)CIK110522樣品中雙去甲氧基姜黃素的變化趨勢(shì)出現(xiàn)差異，其原因可能是炮制過(guò)程中，人為因素的影響，如潤(rùn)制時(shí)間、炒制時(shí)間、炒制程度、煮法的加水量和煮制時(shí)間的掌握等，可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，制定規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的炮制操作規(guī)程尤為必要。本研究為制定莪術(shù)炮制規(guī)范及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

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