茵陳四苓顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙 劍， 陳玉蘭， 蒲清榮， 黃 銳， 楊光華

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

茵陳四苓顆粒是瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，批準(zhǔn)文號(川藥制字Z20070525)，主要由赤芍、梔子、茵陳、大黃、白術(shù)、茯苓等多味中藥組成。具有清熱除濕、利膽退黃的功效，用于慢性活動性乙型肝炎，肝硬化并發(fā)內(nèi)毒素血癥屬肝膽濕熱證，經(jīng)臨床應(yīng)用多年， 療效顯著。為了更好的控制其質(zhì)量，根據(jù)處方中中藥所含化學(xué)成分及其理化性質(zhì)，結(jié)合“君、臣、佐、使”的中醫(yī)藥理論，按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊管理辦法》的要求，采用TLC法對制劑中的茵陳和大黃進(jìn)行定性鑒別[1-3]， 并采用HPLC法同時(shí)定量測定茵陳四苓顆粒中芍藥苷、梔子苷及大黃素、大黃酚，為綜合評價(jià)制劑的內(nèi)在質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

SPD-20A高效液相色譜儀(美國科學(xué)系統(tǒng)公司)，UltimateTM C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，JPGT0328超聲提取器(武漢嘉鵬電子有限公司)，NRB17S3W電冰箱(日本松下)，ZK072型電熱真空干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)，JA203H電子天平(常州幸運(yùn)電子)。芍藥苷(批號110736-200934)，梔子苷(批號110749-200309)，大黃酸(批號0757-200206)，大黃素(批號110756-200110)，大黃酚(批號110796-201118)，大黃(藥用大黃)對照藥材(批號120984-201202)，茵陳(茵陳蒿)對照藥材(批號121555-201101)均購于中國藥品生物制品檢定所；赤芍、梔子、茵陳、大黃等九味中藥購于瀘州市寶光中藥飲片公司，經(jīng)瀘州市藥檢所中藥室袁常珍副主任中藥師鑒定，均符合《中國藥典》2010年版項(xiàng)下規(guī)定；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；娃哈哈純凈水；茵陳四苓顆粒(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院，批號分別為20130217、20130218、20130219)。

2 薄層鑒別

2.1 茵陳的薄層色譜鑒別 取本品10 g，加水50 mL，攪拌溶解，離心，取上清液，用三氯甲烷振搖提取兩次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另按處方制成不含茵陳的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。另取茵陳對照藥材0.5 g，加水100 mL，煎煮30 min，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-丙酮(5∶3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%氫氧化鉀溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾[4-5]，見圖1。

圖1 茵陳的薄層色譜圖

2.2 大黃的薄層色譜鑒別 取本品10 g，加甲醇50 mL，浸泡1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，加鹽酸2.5 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另按處方制成不含大黃的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。另取大黃對照藥材0.1 g，加甲醇20 mL，浸泡1 h，濾過，濾液蒸干，同法制成對照藥材溶液。另取大黃酸、大黃素及大黃酚對照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H 薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾[4-5]，見圖2。

圖2 大黃的薄層色譜圖

3 樣品中成分測定

3.1 茵陳四苓顆粒中芍藥苷、梔子苷定量測定與結(jié)果

3.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Inertsil ODS-SP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水(15∶85)；體積流量1 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫40 ℃。理論塔板數(shù)按芍藥苷計(jì)算應(yīng)不低于4 000[6-8]。

3.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、梔子苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含芍藥苷0.183 mg、梔子苷0.26 mg的混合對照品溶液。

3.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.1.4 陰性對照溶液制備 按處方量并以相同的工藝制備不含赤芍和梔子的陰性對照樣品， 按供試品溶液的制備方法處理，得陰性對照溶液。

3.1.5 線性范圍的考察 分別精密吸取上述對照品溶液2.5、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，按選定的色譜條件測定，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程為Y=1×106X-55 680，r=0.999 8(n=5)，梔子苷為Y=1×106X-13 595，r=0.999 8(n=5)，結(jié)果表明芍藥苷對照品進(jìn)樣量在0.458～3.66 μg范圍與峰面積線性關(guān)系良好，梔子苷對照品進(jìn)樣量在0.65～5.2 μg范圍與峰面積線性關(guān)系良好。

3.1.6 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品及陰性對照溶液各 10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。結(jié)果陰性對照色譜中，在與對照品及供試品色譜圖對應(yīng)保留時(shí)間處無相應(yīng)色譜峰，表明其他成分對測定芍藥苷、梔子苷無干擾，見圖3。

圖3 茵陳四苓顆粒中梔子苷、芍藥苷的HPLC色譜圖

3.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣10 μL測定峰面積，結(jié)果芍藥苷和梔子苷的峰面積RSD分別為1.35%、0.97%(n=5)，表明精密度良好。

3.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行峰面積測定，結(jié)果芍藥苷和梔子苷的峰面積RSD分別為1.06%、1.15%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品6 份， 按“3.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 以“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定每份樣品中芍藥苷和梔子苷的量，結(jié)果芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.657 mg/g，RSD為1.02%，梔子苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.598 mg/g，RSD為1.16%，表明該方法重復(fù)性符合要求。

3.1.10 回收率試驗(yàn) 精密稱取已測定茵陳四苓顆粒(芍藥苷1.655 mg/g，梔子苷3.596 mg/g)6份，每份約0.5 g，分別精密加入一定質(zhì)量濃度的混合對照溶液，按“3.1.3”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件下，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果芍藥苷的平均回收率為97.75%，RSD為1.13%(n=6)，梔子苷的平均回收率為98.27%，RSD為1.08%(n=6)，結(jié)果表明該方法的回收率良好，符合定量測定的要求[9]，見表1。

表1 芍藥苷和梔子苷加樣回收試驗(yàn)

3.1.11 樣品測定 取茵陳四苓顆粒3批(20130217、20130218、20130219)，精密稱定，制成供試品溶液，利用外標(biāo)兩點(diǎn)法測定，計(jì)算，測定結(jié)果見表2。

表2 樣品中芍藥苷和梔子苷測定結(jié)果

3.2 茵陳四苓顆粒中大黃素、大黃酚的測定

3.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Inertsil ODS-SP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；體積流量1 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫40 ℃。理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000[10-11]。

3.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取大黃素對照品1.5 mg、大黃酚對照品2.75 mg，分別置25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，得對照品貯備液，分別精密量取0.1 mL貯備液，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含大黃素0.000 6 mg、大黃酚0.001 1 mg的混合對照品溶液。

3.2.3 供試品溶液的制備 取本品1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm，即得。

3.2.4 陰性對照溶液制備 按處方量并以相同的工藝制備不含大黃的陰性對照樣品， 按供試品溶液的制備方法處理，得陰性對照溶液。

3.2.5 線性范圍的考察 分別精密吸取上述對照品溶液2.5、5、10、20、25 μL注入高效液相色譜儀，按選定的色譜條件測定，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得大黃素的回歸方程為Y=4×106X+1351.9，r=0.999 9(n=5)，大黃酚的回歸方程為Y=6×106X+6 608.6，r=0.999 8(n=5)，結(jié)果表明大黃素對照品進(jìn)樣量在0.001 5～0.015 μg之間與峰面積線性關(guān)系良好，大黃酚對照品進(jìn)樣量在0.002 8～0.028 μg之間與峰面積線性關(guān)系良好。

3.2.6 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品及陰性對照溶液各 10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。結(jié)果陰性對照色譜中，在與對照品及供試品色譜圖對應(yīng)保留時(shí)間處無相應(yīng)色譜峰，表明其他組份對測定大黃素、大黃酚無干擾，見圖4。

圖4 茵陳四苓顆粒中大黃素、大黃酚的HPLC色譜圖

3.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣10 μL測定峰面積，結(jié)果大黃素和大黃酚的峰面積RSD(n=5)分別為1.07%、0.85%，表明精密度良好。

3.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行峰面積測定，結(jié)果大黃素和大黃酚的峰面積RSD分別為1.38%、1.12%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品6 份， 按“3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 以“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定每份樣品中大黃素和大黃酚的量，結(jié)果大黃素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.046 mg/g，RSD為0.98%，大黃酚的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.072 mg/g，RSD為0.82%，表明該方法重復(fù)性試驗(yàn)符合要求。

3.2.10 回收率試驗(yàn) 精密稱取已測定茵陳四苓顆粒(大黃素0.048 mg/g，大黃酚0.075 mg/g)6份，每份約0.5 g，分別精密加入一定量的對照品貯備液，按“3.2.3”項(xiàng)下方法操作，制備所需溶液，按“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件下，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果大黃素的平均回收率為98.04%，RSD為0.68%(n=6)，大黃酚的平均回收率為98.83%，RSD為1.38%(n=6)，結(jié)果表明該方法的回收率良好，符合定量測定的要求，見表3。

3.2.11 樣品測定 取茵陳四苓顆粒3批(20130217、20130218、20130219)，每份一定量，精密稱定，制成供試品溶液，利用外標(biāo)兩點(diǎn)法測定，計(jì)算，測定結(jié)果見表4。

表3 大黃素和大黃酚加樣回收試驗(yàn)

表4 樣品中大黃素和大黃酚測定結(jié)果

4 討論

4.1 TLC 法是中藥鑒定的主要方法，是快速分離和定性分析的一種重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)?！吨袊幍洹?010 年版對常用中藥材及中成藥中主要成分制訂了薄層鑒別方法。本實(shí)驗(yàn)對茵陳四苓顆粒處方中赤芍、梔子、茵陳和大黃進(jìn)行TLC鑒別，結(jié)果表明，系統(tǒng)專屬性強(qiáng)，色譜特征斑點(diǎn)清晰，分離良好，無拖尾現(xiàn)象，可用于茵陳四苓顆粒的定性鑒別標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 測定芍藥苷和梔子苷時(shí)，在流動相的選擇上，某些文獻(xiàn)采用梯度洗脫方式獲得了理想的分離度和塔板數(shù)[12-13]，本實(shí)驗(yàn)先后用不同比例的乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸( 15∶85) 等度洗脫芍藥苷峰已達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不少于4 000，峰形對稱。既節(jié)省時(shí)間,又得到好的分離效果，故選其為本實(shí)驗(yàn)流動相。

4.3 選擇大黃素和大黃酚流動相時(shí)，考慮大黃酸和大黃酚的極性較小，宜采用有機(jī)相比例較大的流動相，且這2種成分都含有酚羥基略顯酸性，故加入酸以抑制拖尾現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)分別考察了0.1%、0.2%、0.5%磷酸及乙酸，結(jié)果選擇0.1%的磷酸峰形良好，故選擇0.1%的磷酸水作為B相。

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